臺灣博碩士論文加值系統

Clostridium sticklandii 此菌株內的鳥胺酸異構酶(D-ornithine aminomutase)可將D-ornithine 催化成(2R，4R)-2，4-diaminopentanoic acid。鳥胺酸異位酶由兩個次單元所組成，分別為OraS及OraE。OraS由121個胺基酸組成，分子量為12800 Da;OraE 由753個胺基酸所組成，分子量為82900 Da。前人研究結果顯示，OraE 蛋白單獨表現時，是以包涵體形式存在。本論文首先找到重新摺疊OraE 蛋白的條件，並針對D-ornithine aminomutase 的活性，討論OraS次單元在催化上扮演的角色。另外，本論文亦發現OraE及OraSE在部分金屬離子存在時，具有蛋白質水解酶活性，本論文也針對此活性，做了初步的探討。

D-Ornithine aminomutase from Clostridium sticklandii catalyzes the 1,2-rearrangement reaction of D-ornithine to (2R,4S)-2,4-diaminopentanoic acid. D-Ornithine aminomutase comprised two subunits. the oraS gene, which encodes a protein of 121 amino acid residues with Mr. 12,800, and oraE gene, which encodes a protein of 753 amino acid residues with Mr. 82,900. According to previus studies, OraE was expressed as inclusion bodies when E.coli was used as expression host. The refolding condition of OraE protein was first established in the dissertation. The role of OraS protein during catalysis was also investigated. Finally, our experimental results show that OraE protein possesses metal dependent proteolytic activity. This novel activity was preliminarily characterized.

目 錄

中文摘要 i
英文摘要 ii
誌謝 iii
目錄 iv
表目錄 vi
圖目錄 vii
簡寫表 iv
第一章 緒論 1
第二章 OraE蛋白性質及重新褶疊條件的探討 10
2.1前言 10
2.2實驗器材與藥品 11
2.2.1 實驗藥品 11
2.2.2 實驗儀器 15
2.3實驗步驟 16
2.3.1 OraE純化 16
2.3.1.1 菌種培養 16
2.3.1.2 破碎菌體 16
2.3.1.3 蛋白質變性 17
2.3.1.4 蛋白質的重新摺疊 17
2.3.1.5 膠體過濾 17
2.3.2 OraE蛋白質水解酶活性測定 18
2.3.2.1 OraE蛋白質水解酶對金屬離子的需求測試 18
2.3.2.2 蛋白質水解酶活性染色 18
2.4結果與討論 19
第三章 OraSE蛋白質水解酶活性分析 25
3.1前言 25
3.2實驗器材與藥品 26
3.2.1 實驗藥品 26
3.2.2 實驗儀器 29
3.3實驗步驟 29
3.3.1 OraSE純化 29
3.3.1.1 菌種培養 29
3.3.1.2 破碎菌體 30
3.3.1.3 陰離子交換管柱 30
3.3.1.4 疏水性交換管柱 31
3.3.2 OraSE活性分析 32
3.3.2.1 OraSE最適溫度的測定 32
3.3.2.2 OraSE最適pH測定 32
3.3.2.3 OraSE蛋白質水解速率測定 33
3.3.3 蛋白水解酶活性染色 33
3.3.3.1 自OraSE中分離OraE蛋白 33
3.3.3.2 OraE蛋白質變性與重新摺疊 34
3.3.3.3 蛋白質水解酶活性染色 34
3.4結果與討論 35
第四章 OraE截斷及化學修飾 45
4.1前言 45
4.2實驗器材與藥品 46
4.2.1 實驗藥品 46
4.2.2 實驗儀器 48
4.3實驗步驟 48
4.3.1 OraE蛋白序列片段活性測試 48
4.3.1.1 oraE基因截短 48
4.3.1.2 OraE1蛋白純化及水解酶活性測試 48
4.3.1.3 OraE2蛋白純化及水解酶活性測試 49
4.3.1.4 OraE3蛋白純化及水解酶活性測試 49
4.3.1.5 OraE6蛋白純化及水解酶活性測試 49
4.3.2 DEPC測試 51
4.3.2.1 DEPC處理 51
4.3.2.2 DEPC反應 51
4.4結果與討論 52
第五章 總結與討論 60
參考文獻 61

參考文獻

1.R. Somack, R. N. Costilow, Biochem, Vol.12, 1973, pp.2597-2604.
2.H. A. Barker, Ann. Rev. Biochem.. Vol.50, 1981, pp.23-40.
3.L.G. Ljungdahl, J. Hugenholtz, and J. Wiegel, in Clostridia(Mintoz, N. P., and Clarke, D. P.,eds)Chapter 5,Plenum Press, New York.1989.
4.H. P. Chen, C. F. Lin, Y. R. Lee ,S. S. Tsay, and S. H. Wu, J. Bacteriol. Vol.182, pp.2052-2054.
5.J. R. Andreesen, H. Bahl, and G. Gottschalk, in Clostridia(Mintoz, N. P., and Clarke, D. P., eds)Chapter 2, Plenum Press, New York. 1989.
6.H. P. Chen, F. C. Hsui, L.Y. Lin, C. T. Ren and S. H. Wu, Eur. J. Biochem. Vol.271, 2004, pp.4293–4297.
7.M. M. Carrió and A. Villaverde, J. Biotechnol. Vol.96, 2002, pp.3–12.
8.V. Daggett, Curr. Opin. Biotechnol., Vol.9, 1998, pp.157-163.
9.黃裕斌、姚富洲、許晉銓、佟穎生、歐馨婷、蘇名儀，生物化學原理，台灣，合記圖書出版社，2003，第130-131頁。
10.J. Michael north, Microbiol. Rev, 1982, pp.308-340.
11.H. P. Chen, F. C. Hsui, L. Y. Lin, C. T. Ren, and S. H. Wu, Eur. J. Biochem, Vol.271, 2004, pp.4293-4297.
12.H. P. Chen, S. H. Wu, Y. L. Lin, C. M. Chen and S. S. Tsay, J.Biol.Chem, Vol.276, 2001, pp.44744-44750.
13.F. Berkovitch, E. Behshad, K. H. Tang, A.Eva Enns, A.Perry Frey, and L.C. Drennan, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, Vol.101, 2004, pp.15870-15875.
14.J. V. Nesatyy, V. B. Rutishauser, I.Rik, L. Eggen, J. Marc, F. Suter, Analtyst, Vol.130, 2005, pp.1087-1097.
15.C. K. Garrison, R. H. Himes, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.67, 1975, pp.1251-1255.
16.J. Leiper, M. Rust, J. McDonald, N. Vallance, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, Vol.99, 2002, pp.13527-13532.
17.J. Sun, L. Xu, J. P. Eu, J. S. Stamler, G. Meissner, J. Biol. Chem, Vol.278, 2003, pp.8184-8189.