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研究生:張順芳
研究生(外文):Shuen-Fang Chang
論文名稱:化學添加劑提升動物細胞重組蛋白生產之研究
論文名稱(外文):Improvement of Recombinant Proteins Production in NS0 Myeloma Cells under Serum-Free Conditions: Effects of Stimulatory Agents and Antioxidants.
指導教授:余琬琴
口試委員:張金全紀威光
口試日期:2006-07-29
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺北科技大學
系所名稱:有機高分子研究所
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:101
中文關鍵詞:骨髓瘤細胞誘導劑抗氧化劑化學合成培養基
外文關鍵詞:Mammalian cellsstimulatory agentsa-interferon
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動物細胞大量培養是近代生技產業生產高複雜度蛋白質藥物的重要技術之 一。由於單株抗體等蛋白質藥物的蓬勃發展,進入臨床前與臨床試驗的蛋白質藥物與日俱增,核准上市的蛋白質藥物也快速增加,因此如何快速增加產量並降低製造成本來滿足這些需求成為重要課題。在培養基中添加誘導劑是快速提高蛋白質產量的方法,常見的誘導劑有sodium butyrate、DMSO等,但這些誘導劑常造成細胞凋亡,限制了蛋白質的最終產量。本論文針對一生產基因重組干擾素的骨髓瘤細胞(NS0),研發利用誘導劑與抗氧化劑的添加來提升蛋白質產量的方法,此細胞株已被馴化至一化學組成無血清培養基,本實驗室先前比較數種誘導劑,發現丙酸(sodium propionate)對NS0細胞具有獨特的效用,重組蛋白質產量高於文獻中常用的丁酸。以轉瓶批次培養,丁酸的最適濃度約為0.5mM,此濃度不會造成細胞死亡,且蛋白質產量提升了三分之ㄧ;丙酸適合濃度為1.0-2.0mM,蛋白質產量提高一倍。
本論文首先以2L的生物反應器驗證丙酸的效果,結果與轉瓶的實驗吻合。接著測試四種抗氧化劑L-ascorbic acid、N-acetyl L-cysteine、Aurintricarboxylic acid、Pyrrolidine dithiocarbamate 對NS0細胞的影響,以T型培養瓶為實驗系統,找出合適的添加濃度後,在與誘導劑搭配使用,期能將誘導劑造成的凋亡減到最低,而進一步提升蛋白質產量。結果顯示N-acetyl L-cysteine與誘導劑搭配使用,可進一步提升蛋白質產量。
The large-scale culture of mammalian cells has become an important part of the biotechnology industry, for the production of many therapeutic and diagnostic proteins. Because high protein dosages are often required for therapeutic efficacy, it is highly desirable to increase the yield and lower the manufacturing cost of therapeutic proteins. A simple way to rapidly enhance protein productivity is the addition of stimulatory agents to the growth media, such as sodium butyrate (NaBu) and DMSO. However, the beneficial effects of these stimulatory agents are often compromised by their growth inhibiting and apoptosis inducing effects, thus limiting the final protein yield. In order to improve the low protein productivity in a recombinant NS0 cell producing α-interferon, we first compared various stimulatory agents for their protein production enhancing effects and then examined several antioxidants for their ability to reduce the cytotoxic effects of stimulatory agents. In previous studies we found that sodium propionate is a better protein production
ii i
enhancing agent than the well known NaBu. Sodium propionate is more effective and less toxic. Under batch culture conditions in spinner flasks, the optimal NaBu concentration was about 0.5mM, and the final protein titer was increased 30%. On the other hand, the optimal concentration for sodium propionate was about 1-2mM, and the final protein titer was doubled.
In this thesis, the protein production stimulatory effect of sodium propionate was confirmed using 2L bioreactor and the result agree well with those of spinner flask batch cultures. In order to further increase the protein yield, we investigated the effect of four antioxidants: L-ascorbic acid, N-acetyl L-cysteine (NAC), Aurintricarboxylic acid (ATA), and Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) on cell growth and protein production. Results indicate that NAC is the only antioxidant tested with a positive effect on protein production. When added simultaneously with sodium propionate, NAC further increased cell viability, culture longevity and protein yield. The other antioxidant tested all had negative impacts on protein production.
目錄

摘 要 i
ABSTRACT ii
第一章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 研究動機 1
第二章 文獻回顧 3
2.1 細胞死亡 3
2.2 誘導劑 6
2.3 抗氧化劑 7
第三章 實驗材料與方法 8
3.1 藥品與材料 8
3.2 儀器 10
3.3 細胞株 10
3.4 培養基 11
3.5 細胞凍存與解凍 11
3.6 繼代培養 12
3.7 細胞培養裝置 12
3.8 抗氧化劑的測試 13
3.9 交互作用測試 13
3.10 重組蛋白質定量分析 14
第四章結果與討論 16
4.1 誘導劑的影響 16
4.2 添加抗氧化劑對細胞影響 39
4.3 添加誘導劑與抗氧化劑交互作用 56
4.4 饋料批次培養添加誘導劑與抗氧化劑交互作用 91
第五章 結論與未來展望 98
5.1 結論 98
5.2 未來展望 98
參考文獻 99

圖目錄

圖2.1 細胞壞死(necrosis) 與細胞凋亡(apoptosis)示意圖 4
圖2.2 細胞凋亡中心機制與誘發凋亡的訊息傳遞途徑 5
圖4.1 添加丙酸或丁酸對NS0細胞總生長濃度的影響 18
圖4.2 添加丙酸或丁酸對NS0存活細胞生長濃度的影響 19
圖4.3 添加丙酸或丁酸對NS0細胞生長存活率的影響 20
圖4.4 添加丙酸或丁酸對NS0細胞培養Glutamine消耗的影響 21
圖4.5 添加丙酸或丁酸對NS0細胞培養Glucose消耗的影響 22
圖4.6 添加丙酸或丁酸對NS0細胞培養產生Lactate的影響 23
圖4.7 添加丙酸或丁酸對NS0細胞培養代謝氨的影響 24
圖4.8 添加丙酸或丁酸對NS0細胞培養細胞液O2含量的影響 25
圖4.9 添加丙酸或丁酸對NS0細胞培養細胞液CO2含量的影響 26
圖4.10 添加丙酸或丁酸對NS0細胞生產干擾素的影響 27
圖4.11 添加丙酸或丁酸對NS0生產干擾素與viable cell time integral的關係 27
圖4.12 添加丙酸或丁酸對NS0單位細胞干擾素產率的影響 28
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 30
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 31
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 32
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 33
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 34
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 35
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 36
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 37
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 38
圖4.13(續) 添加丙酸或丁酸對NS0細胞氨基酸代謝的影響 39
圖4.14 添加不同濃度ATA對NS0細胞總生長濃度的影響 40
圖4.15 添加不同濃度ATA對NS0存活細胞生長濃度的影響 41
圖4.16 添加不同濃度ATA對NS0細胞生長存活率的影響 42
圖4.17 添加不同濃度ATA對NS0細胞生產干擾素的影響 43
圖4.18 添加不同濃度ATA對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 44
圖4.19 添加不同濃度ATA對NS0單位細胞干擾素產率的影響 45
圖4.20 添加不同濃度PDTC對NS0細胞總生長濃度的影響 46
圖4.21 添加不同濃度PDTC對NS0存活細胞生長濃度的影響 47
圖4.22 添加不同濃度PDTC對NS0細胞生長存活率的影響 48
圖4.23 添加不同濃度PDTC對NS0細胞生產干擾素的影響 49
圖4.24 添加不同濃度PDTC對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 49
圖4.25 添加不同濃度PDTC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 50
圖4.26 添加不同濃度NAC對NS0細胞總生長濃度的影響 51
圖4.27 添加不同濃度NAC對NS0存活細胞生長濃度的影響 52
圖4.28 添加不同濃度NAC對NS0細胞生長存活率的影響 53
圖4.29 添加不同濃度NAC對NS0細胞生產干擾素的影響 54
圖4.30 添加不同濃度NAC對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 55
圖4.31 添加不同濃度NAC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 56
圖4.32 添加丙酸與L-ascorbic acid對NS0細胞總生長濃度的影響 57
圖4.33 添加丙酸與L-ascorbic acid對NS0存活細胞生長濃度的影響 58
圖4.34 添加丙酸與L-ascorbic acid對NS0細胞生長存活率的影響 59
圖4.35 添加丙酸與L-ascorbic acid對NS0細胞生產干擾素的影響 60
圖4.36 添加丙酸與L-ascorbic acid對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 61
圖4.37 添加丙酸與L-ascorbic acid對NS0單位細胞干擾素產率的影響 61
圖4.38 添加丙酸與PDTC對NS0細胞總生長濃度的影響 62
圖4.39 添加丙酸與PDTC對NS0存活細胞生長濃度的影響 63
圖4.40 添加丙酸與PDTC對NS0細胞生長存活率的影響 64
圖4.41 添加丙酸與PDTC對NS0細胞生產干擾素的影響 65
圖4.42 添加丙酸與PDTC對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 66
圖4.43 添加丙酸與PDTC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 67
圖4.44 添加丙酸與ATA對NS0細胞總生長濃度的影響 68
圖4.45 添加丙酸與ATA與NS0存活細胞生長濃度的影響 69
圖4.46 添加丙酸與ATA對NS0細胞生長存活率的影響 70
圖4.47 添加丙酸與ATA對NS0細胞生產干擾素的影響 71
圖4.48 添加丙酸與ATA對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 72
圖4.49 添加丙酸與ATA對NS0單位細胞干擾素產率的影響 73
圖4.50 添加丙酸與NAC對NS0細胞總生長濃度的影響 74
圖4.51 添加丙酸與NAC對NS0存活細胞生長濃度的影響 75
圖4.52 添加丙酸與NAC對NS0細胞生長存活率的影響 76
圖4.53 添加丙酸與NAC對NS0細胞生產干擾素的影響 77
圖4.54 添加丙酸與NAC對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 78
圖4.55 添加丙酸與NAC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 79
圖4.56 添加較高濃度丙酸與NAC對NS0細胞總生長濃度的影響 80
圖4.58 添加較高濃度丙酸與NAC對NS0細胞生長存活率的影響 82
圖4.59 添加較高濃度丙酸與NAC對NS0細胞生產干擾素的影響 83
圖4.60 添加丙酸與NAC對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 84
圖4.61 添加丙酸與NAC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 85
圖4.62 添加丁酸與NAC對NS0細胞總生長濃度的影響 86
圖4.63 添加丁酸與NAC對NS0存活細胞生長濃度的影響 87
圖4.64 添加丁酸與NAC對NS0細胞生長存活率的影響 88
圖4.65 添加丁酸與NAC對NS0細胞生產干擾素的影響 89
圖4.66 添加丁酸與NAC對NS0細胞生產干擾素與viable cell time integral的關係 90
圖4.67 添加丁酸與NAC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 91
圖4.68 餽料批次培養添加丙酸與NAC對總細胞生長濃度的影響 92
圖4.69 餽料批次培養添加丙酸與NAC對對NS0存活細胞生長濃度的影響 93
圖4.70 餽料批次培養添加丙酸與NAC對NS0細胞生長存活率的影響 94
圖4.71 餽料批次培養添加丙酸與NAC對NS0細胞對NS0細胞生產干擾素的影響 95
圖4.72 餽料批次培養添加丙酸與NAC對NS0生產干擾素與viable cell time integral的關係 96
圖4.73 餽料批次培養添加丙酸與NAC對NS0單位細胞干擾素產率的影響 97
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