臺灣博碩士論文加值系統

粒線體為真核細胞生物能量代謝調節的主要胞器，藉由電子傳遞鏈和氧化磷酸化反應來提供生物體細胞ATP的來源。粒線體生合成必須依靠細胞核染色體所編碼之轉錄因子。最近一些研究指出粒線體也參與細胞凋亡及控制細胞增生與分化作用，由此可知粒線體在生物體內的重要性，因此了解粒線體基因生合成的表現，將有助於治療一些因粒線體缺陷所造成的疾病。目前粒線體生合成的研究中主要探討分兩個機轉，第一路徑是透過粒線體轉錄因子A，第二條路徑是藉由具荷爾蒙性質的維生素例如:維生素A來調節其粒線體生合成。而視網酸證實也證實跟粒線體調控具有其相關性。本實驗目的是建立一個粒線體生合成的細胞膜式，探討影響粒線體生合成營養素及其轉錄因子之活性的調控機轉，另外研究視網酸是否會影響mtRXR進入到粒線體的量，而定義出粒線體內的傳導路徑。實驗方法以2~25uM的9-cis RA培養human osteosarcoma 143B thymidine kinase negative cells (143B TK－ cells） 24及48小時。再以MTS試劑偵測視網酸對細胞存活率之毒性影響，藉由光學顯微鏡觀察細胞型態之變化。以同步定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)和西方墨點分別分析細胞中粒線體及細胞核mRNA和蛋白質的表現量藉此評估粒線體生合成之狀況。也偵測粒線體生合成相關因子例如PGC-1、mtTFA、 RXR、NRF-1的mRNA及蛋白質的表現量。結果顯示9-cis RA顯著增加細胞核DNA轉錄的氧化磷酸化蛋白質mtTFA、NRF-1、PGC-1的mRNA表現量。例如:經9-cis RA處理48小時後，PGC-1的mRNA表現量在溶劑組、2uM組、5uM組、10uM組、25uM組分別為控制組的8.60、0.60、0.67、0.70、2.40倍。9-cis RA顯著增加粒線體DNA轉錄的氧化磷酸化蛋白質cytochrome c oxidase、及細胞核DNA轉錄的氧化磷酸化蛋白質retinoid X receptor α (RXRα)、mtTFA、NRF-1、PGC-1 、mtRXRα的表現量。例如: 經9-cis RA處理48小時後，RXRα的蛋白質表現量在溶劑組、2uM組、5uM組、10uM組、25uM組分別為控制組的o.71、1.27、0.90、4.08、1.20倍。另外也顯示9-cis RA會影響到mtRXRα到粒線體的量，間接活化粒線體的轉錄及轉譯作用。最後經實驗數據指出9-cis RA會藉由刺激RXRα、mtTFA、PGC-1、NRF的大量表現，並藉由這些因子的調控間接影響粒線體之生合成。

The role of mitochondria has been long restricted to fuel metabolism. Recently studies have established that organelle activity regulates cell proliferation and differentiation. The knowledge for mitochondrial biogenesis control pathway will help cured genetic diseases caused by mtDNA deletion and mutation. Mitochondrial biogenesis is regulated by two known regulated pathways. The first pathway is through the regulation of nuclear-encoded mitochondrial transcription factor A (mtTFA). The second mechanism involved the nutrients have hormone properties and cognate receptors to regulate the mitochondrial gene biogenesis.
The retinoid acid X receptor alpha (RXRα) identified in the mitochondrial matrix has high affinity with retinoic acid. To examine these hypotheses, we determined whether retinoic acid would modulate mitochondrial biogenesis. This experiment was to establish a study model for mitochondrial biogenesis and identified mitochondrial signaling pathway in nutrient sensing. Furthermore, roles of retinoic acid affect the level of mtRXRα imported to the mitochondria and regulate the expression of mtDNA will be examined.
Various amount of 9-cis RA (2~25uM) were given to culture human osteosarcoma 143B TK－ cells for 24 and 48hours. The cell morphology did not change afterhours of treatment. From Real-time PCR analysis, the levels of mRNA expression of nuclear DNA-enconded mtTFA、 RXR and NRF-1 were significantly increased by 9-cis RA. For instances, after giving 9-cis RA treatments for 48 hours, the mRNA levels of PGC-1 in the vehicle, 2uM, 5uM, 10uM and 25uM groups were 8.60、0.60、0.67、0.70、2.40 folds of the control group. Western blot data revealed that levels of protein expression of nuclear DNA-enconded RXRα, mtTFA, NRF-1, PGC-1 and mtRXRα，and mitochondrial DNA-enconded COXⅠwere increased by 9-cis RA. For instance, after giving 9-cis RA treatments for 48 hours, the levels of protein expression of RXRα in the vehicle, 2uM, 5uM, 10uM and 25uM groups were o.71、1.27、0.90、4.08、1.20 folds of the control group.
This study also proves that the 9-cis RA modulates the level of mtRXR imported into the mitochondria, and activates the transcription and translation of mitochondrial genes. Elevated expression of RXRα and transcription factors including PGC-1, NRF and mtTFA through 9-cis R A treatment , while upregulates mitochondrial biogenesis.

目錄
中文摘要………………………………………………………………I
英文摘要………………………………………………………………Ⅲ
致謝……………………………………………………………………Ⅴ
目錄……………………………………………………………………VIII
表目錄………………………………………………………………ⅩⅠ
圖目錄………………………………………………………………ⅩⅡ
縮寫表………………………………………………………………ⅩⅣ
第一章 緒論……………………………………………………………1
第一節 研究動機………………………………………………1
第二節 研究目的………………………………………………3
第二章 文獻回顧………………………………………………4
第一節 粒線體基因……………………………………………4
第二節 粒線體和細胞核的相互作用…………………………5
第三節 維生素A類物質及其接受器…………………………6
第四節 PGC-1的功能及角色之探討…………………………6
第五節 轉錄因子之間的相互作用……………………………7
第六節 粒線體轉錄因子A和細胞核呼吸因子………………8
第七節 RXR在細胞核和粒線體中的角色………………………9
第三章 實驗設計……………………………………………………11
第一節 研究架構……………………………………………11
第二節 細胞培養……………………………………………12
第三節 藥劑配製……………………………………………13
第四節 引子設計……………………………………………13
第五節 RNA萃取……………………………………………14
第六節 反轉錄………………………………………………14
第七節 同步定量聚合酶連鎖反應…………………………15
第八節 總蛋白質萃取………………………………………15
第九節 粒線體蛋白質萃取…………………………………16
第十節 蛋白質定量…………………………………………16
第十一節 西方墨點法…………………………………………17
第十二節 統計方法……………………………………………19
第四章 結果…………………………………………………………20
第一節 9-順式視網酸對143B TK- 細胞存活率及生長型態之影響…………………………………………………20
第二節 9-順式視網酸對143B TK- 細胞基因表現量之影響.21
第三節 9-順式視網酸對143B TK- 細胞蛋白質表現量之影 響……………………………………………………23
第四節 9-順式視網酸對RXRα細胞中分佈之影響………26
第五章 討論…………………………………………………………28
第一節 9-順式視網酸增加細胞核DNA轉錄之粒線體基因
的表現量探討…………………………………………28
第二節 9-順式視網酸增加mtTFA基因的表現量來提高粒線
體的生合成……………………………………………29
第三節 9-順式視網酸對PGC-1基因表現之影響……………30
第四節 9-順式視網酸對RXRα基因表現之影響……………31
第五節 9-順式視網酸對於粒線體RXRα基因之表現探討…32
第六章 總結…………………………………………………34
第七章 參考文獻……………………………………………………35
表目錄
表01.Real-time分析由細胞核DNA轉錄的基因之引子設計……39
表02.西方墨點分析法使用的一級體……………………………40
表03.經9-順式視網酸投予24和48小時後，對143B TK—細胞mRNA表
現量之整理…………………………………………………41
表04.經9-順式視網酸投予24和48小時後，對143B TK—細胞蛋白質表現量之整理……………………………………………………42
圖目錄
圖01.人類粒線體基因圖…………………………………………43
圖02.細胞核和粒線體基因皆會提供呼吸鏈上基因的表現……44
圖03.PGC-1調控下游基因………………………………………45
圖04.PGC-1具相關性的作用因子………………………………46
圖05.荷爾蒙調節粒線體轉錄作用的方式與細胞核層級相似…47
圖06.經9-cis RA 處理24小時之細胞存活率比較圖…………48
圖07.經9-cis RA 處理48小時之細胞存活率比較圖……………49
圖08.經9-cis RA 處理48小時之細胞形態圖……………………50
圖09.經9-cis RA 處理24小時後NRF-1基因mRNA表現量……51
圖10.經9-cis RA 處理48小時後NRF-1基因mRNA表現量……52
圖11.經9-cis RA 處理24小時後mtTFA基因mRNA表現量……53
圖12.經9-cis RA 處理48小時後mtTFA基因mRNA表現量……54
圖13.經9-cis RA 處理24小時後PGC-1基因mRNA表現量……55
圖14.經9-cis RA 處理48小時後PGC-1基因mRNA表現量……56
圖15.經9-cis RA 處理24小時後mtTFA基因蛋白質表現量……57
圖16 經9-cis RA 處理48小時後mtTFA基因蛋白質表現量………58
圖17.經9-cis RA 處理48小時後PGC-1基因蛋白質表現量………59
圖18.經9-cis RA 處理24小時後RXRα基因蛋白質表現量………60
圖19.經9-cis RA 處理48小時後RXRα基因蛋白質表現量………61
圖20.經9-cis RA 處理24小時後COXⅠ基因蛋白質表現量………62
圖21.經9-cis RA 處理48小時後COXⅠ基因蛋白質表現量……63
圖22.經9-cis RA 處理24小時後細胞質RXR基因蛋白質表現量…64
圖23.經9-cis RA 處理48小時後細胞質RXR基因蛋白質表現量65
圖24.經9-cis RA 處理24小時後mtRXR基因蛋白質表現量……66
圖25.經9-cis RA 處理48小時後mtRXR基因蛋白質表現量……67
圖26.粒線體分離實驗純度鑑定實驗………………………………68
圖27.經9-cis RA 處理48小時後粒線體COXⅠ基因蛋白質表現量………………………………………………………………………69

















表目錄
表01. Real-time分析由細胞核DNA轉錄的基因之引子設計……39
表02.西方墨點分析法使用的一級體…………………………….....40
表 03.經9-順式視網酸投予24和48小時後，對143B TK—細胞mRNA表
現量之整理…………………………………………………....41
表 04.經9-順式視網酸投予24和48小時後，對143B TK—細胞蛋白質表現量之整理…………………………………………………….42















圖目錄
圖01.人類粒線體基因圖…………………………………………..44
圖02.細胞核和粒線體基因皆會提供呼吸鏈上基因的表現……..45
圖 03. PGC-1調控下游基因……………………………………….......46
圖04. PGC-1具相關性的作用因子………………………………...47
圖05.荷爾蒙調節粒線體轉錄作用的方式與細胞核層級相似…...48
圖06. 經9-cis RA 處理24小時之細胞存活率比較圖…………....49
圖07. 經9-cis RA 處理48小時之細胞存活率比較圖……………50
圖08. 經9-cis RA 處理48小時之細胞形態圖……………………51
圖09. 經9-cis RA 處理24小時後NRF-1基因mRNA表現量…..52
圖10. 經9-cis RA 處理48小時後NRF-1基因mRNA表現量…..53
圖11. 經9-cis RA 處理24小時後mtTFA基因mRNA表現量…..54
圖12. 經9-cis RA 處理48小時後mtTFA基因mRNA表現量…...55
圖13. 經9-cis RA 處理24小時後PGC-1基因mRNA表現量……56
圖14. 經9-cis RA 處理48小時後PGC-1基因mRNA表現量…….57
圖15. 經9-cis RA 處理24小時後mtTFA基因蛋白質表現量……..58
圖16. 經9-cis RA 處理48小時後mtTFA基因蛋白質表現量……….59
圖17. 經9-cis RA 處理48小時後PGC-1基因蛋白質表現量……….60

圖18. 經9-cis RA 處理24小時後RXRα基因蛋白質表現量…….61
圖19. 經9-cis RA 處理48小時後RXRα基因蛋白質表現量…….62
圖20. 經9-cis RA 處理24小時後COXⅠ基因蛋白質表現量……63
圖21. 經9-cis RA 處理48小時後COXⅠ基因蛋白質表現量…….64
圖22. 經9-cis RA 處理24小時後細胞質RXR基因蛋白質表現量.65
圖 23. 經9-cis RA 處理48小時後細胞質RXR基因蛋白質表現量66
圖 24. 經9-cis RA 處理24小時後mtRXR基因蛋白質表現量……..67
圖 25. 經9-cis RA 處理48小時後mtRXR基因蛋白質表現量……68
圖26. 粒線體分離實驗純度鑑定實驗………………………………...69
圖27. 經9-cis RA 處理48小時後粒線體COXⅠ基因蛋白質表現量………………………………………………………………..70

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