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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:邱逸雲
研究生(外文):Yi-Yun Ciou
論文名稱:一新穎膜型鳥苷酸環化酶受體G在生殖系統所扮演的角色功能性分析
論文名稱(外文):Functional Characterization of a Novel Receptor Mouse Guanylyl Cyclase G (mGC-G) in Reproduction System
指導教授:黃彥華黃彥華引用關係林美香林美香引用關係
指導教授(外文):Yen-Hua HuangMei-shan Lin
學位類別:碩士
校院名稱:臺北醫學大學
系所名稱:醫學研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:醫學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:72
中文關鍵詞:鳥苷酸環化酶獲能作用精子體外受精
外文關鍵詞:guanylyl cyclasecapacitationspermin vitro fertilization
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本實驗室在小鼠睪丸中新發現受體型guanylyl cyclase,命名為mGC-G。為了研究其蛋白表現,我們使用抗extracellular domain(ECD)之抗體中和mGC-G作用。由RT-PCR與免疫組織染色證實mGC-G的mRNA與蛋白主要表現在睪丸中的精細胞(spermatid)與精子(spermatozoa);mGC-G也表現於卵巢中的濾泡細胞與卵。利用流式細胞儀與共軛聚焦顯微鏡顯示mGC-G位於精子細胞膜上,分佈在頂體與尾部中段(midpiece)。有趣的是,利用西方墨點法(western blot)顯示睪丸中的mGC-G分子量約為180 kDa,而精子被運輸至附睪後mGC-G被水解成分子量約為48 k Da的蛋白,而表現於成熟精子上。本論文的重點在於研究mGC-G的生理功能。我們分別利用體外的細胞實驗與mGC-G基因剔除鼠來做近一步探討:(一)體外細胞培養實驗部份,我們使用抗ECD之抗體(anti-ECD Ab)來中和mGC-G作用而達到抑制的效果。精子受到牛的血清蛋白(BSA)刺激而活化,產生[Ca2+]i上升,蛋白質磷酸化(protein tyrosine phosphorylation),泳動力增加。預先與anti-ECD Ab培養的精子,再加入BSA刺激後,其[Ca2+]i上升,蛋白質磷酸化(protein tyrosine phosphorylation),泳動力增加等現象皆受到明顯的抑制。(二)建立mGC-G基因剔除鼠來更進一步研究mGC-G在活體內的功能,mGC-G-/-小鼠發育並無明顯異常,然而在自然狀況下的生育力,null mice互相交配顯示其生殖力受到抑制。而在體外授精(in vitro fertilization)的實驗中,null mice的排卵數量與野生型無明顯差異,但null公鼠精子與null母鼠卵子結合,其受精比例明顯下降。綜合以上研究結果顯示,mGC-G表現在睪丸中的精細胞與精子,而在運送到附睪末端後mGC-G受到水解修飾,表現於成熟精子細胞膜上。在生理活性的部份,mGC-G可能參與精子之訊息傳遞,影響精子之泳動力,與[Ca2+]i調控及磷酸化現象的產生有關。而將mGC-G的基因剔除,造成mGC-G基因剔除鼠生育力受損,顯示mGC-G在生殖生理的訊息傳遞上扮演重要的角色。
We recently identified a novel testis-enriched receptor guanylyl cyclase (GC) in the mouse, designated mGC-G. To further investigate its protein expression and function, we generated a neutralizing antibody specifically against the extracellular domain of this receptor. Reverse transcriptase (RT)-PCR and immunohistochemical analyses show that mGC-G is predominantly expressed from round spermatids to spermatozoa in mouse testis at both mRNA and protein levels. In female genital tract, mGC-G also has a significant expression in granulosa cell and zona pellucida in the ovary by immunohistochemistry. Flow cytometry and confocal immunofluorescence reveal that mGC-G is a cell-surface protein restricted to the plasma membrane overlying the acrosome and the midpiece of the flagellum in mature sperm. Interestingly, Western-blot analysis demonstrates that testicular mGC-G harbors an apparent molecular mass of approximately 180 kDa, but is subject to a limited proteolysis during epididymal sperm transport, resulting in a smaller fragment tethered on mature sperm surface. By utilizing Fluo-3 cytometrical analysis and computer-assisted sperm assay, we found that albumin-induced elevation of sperm [Ca2+]i level, protein tyrosine phosphorylation associated with capacitation and progressive motility are markedly reduced by pre-incubation of the anti-mGC-G neutralizing antibody. To further characterize mGC-G fuction in vivo, we generate mGC-G knock-out mice. Preliminary results show that the fertility of mGC-G null mice is reduced both in vivo and in vitro. Together, this study provides evidence that mGC-G is proteolytically modified in mature sperm membrane and suggests that mGC-G-mediated signaling may play a critical role in gamete/reproductive biology.
縮寫表…………………………………………………………………………....... 1
目錄……………………………………………………………………………....... 2
圖次、表次…………………………………………………………………………. 4
中文摘要…………………………………………………………………………... 5
英文摘要………………………………………………………………………....... 6
第一章 緒論………………………………………………………………………. 7
1.1 生殖機制的總覽….................................................................................... 7
1.2 精子的獲能作用………………………………………………………… 7
1.3 GC family的介紹………………………………………………………… 9
1.3.1 Guanyly cyclase family概述……………………………………....... 9
1.3.2 已知GC在生殖系統的作用……………………………………....... 10
1.3.3 GC-G的發現與文獻探討:rat GC-G與mouse GC-G……………….. 12
1.3.3.1 rat GC-G…………………………………………………………… 12
1.3.3.2 mouse GC-G……………………………………………………….. 12
1.4 主要研究方向…………………………………………………………… 13
第二章 實驗材料和方法…………………………………………………………. 15
2.1 藥品與材料…………………………………………………………….. 15
2. 2 研究方法……………………………………………………………....... 16
2.2.1 即時定量聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time PCR analysis)……………………………………………..…………………….. 16
2.2.2 anti-mGC-G antibody的製備…………………..………………….... 16
2.2.3 精子的製備………………………..………………………………... 16
2.2.4 流式細胞儀(Flow cytometry)……………………………………... 17
2.2.5 組織學的檢測(Histological studies)………………………………. 17
2.2.6 雌鼠動情周期之判定…………………………………………………. 18
2.2.7 西方墨點法(Western blot)…………………………………………. 18
2.2.8 精子泳動力分析(Computer assisted sperm analysis)……………... 18
2.2.9 細胞內cAMP含量分析……………………………………………. 19
2.2.10 mouse GC-G基因剔除鼠(Generation of mouse GC-G knock-out mice)………………………………………………………………………. 20
2.2.11 受孕力分析(In vivo and in vitro fertilization).............................. 20
2.2.12 統計方法………………………………………………………....... 21
第三章 實驗結果…………………………………………………………………. 22
3.1 Anti-mGC-G antibody的製備…………………………………………… 22
3.2 mGC-G在出生後小鼠睪丸的表現…………………………………........ 22
3.3 mGC-G在小鼠生殖系統的分佈……………………………………........ 22
3.3.1 mGC-G表現於睪丸中的成熟精子…..….………………………….. 22
3.3.2 mGC-G表現於成熟小鼠精子的細胞膜上…………………………. 23
3.3.3 mGC-G表現於卵巢中的濾泡細胞,以及卵的細胞膜……………... 23
3.4 以西方墨點法鑑定mGC-G在睪丸與精子上的表現……..…………… 23
3.5 mGC-G在成熟精子的生理功能分析………………………………........ 23
3.5.1 精子進行獲能作用時,mGC-G參與[Ca2+]i的調控……………... 23
3.5.2 mGC-G參與精子獲能作用時蛋白磷酸化的表現……………….. 26
3.5.3 mGC-G與sAC的關係……………………………………………. 26
3.6 mGC-G對於精子泳動力的影響………………………………………… 27
3.7 mGC-G基因剔除鼠…………………………………………………........ 27
3.8 mGC-G對精子受孕力的影響………………………………………........ 28
3.8.1 In vivo fertilization…………………………………………………... 28
3.8.2 In vitro fertilization…………………………………………………... 29
3.9 mGC-G基因剔除之精子在BSA刺激下蛋白磷酸化的程度…………. 30
第四章 討論……………………………………………………………............... 31
4.1 mGC-G的分子量……….…...........................………………………........ 31
4.2 mGC-G參與精子獲能作用的訊息傳遞…………………………..…….. 32
4.3 mGC-G基因剔除鼠於受孕力的表現………………………………........ 33
4.4 mGC-G功能總述及推測……………………………………………........ 34
第五章 參考文獻…………………………………………………………………... 36
第六章 圖表…………………………………………………………………....... 40
第七章 附錄……………………………………………………………………..
72
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