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研究生:陳彥宇
研究生(外文):Yen-Yu Chen
論文名稱:微生物Pseudomonas aeruginosa PAO1的葡萄糖去氫化酶於生物燃料電池之應用
論文名稱(外文):Application of Glucose Dehydrogenase of Pseudomonas aeruginosa PAO1 on Biofuel cell
指導教授:康世旭
學位類別:碩士
校院名稱:元智大學
系所名稱:生物科技暨生物資訊研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:75
中文關鍵詞:生物燃料電池葡萄糖去氫化酶
外文關鍵詞:biofuel cellglucose dehydrogenase
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本研究從 Pseudomonas aeruginosa PAO1中分離純化葡萄糖去氫化酶 (GDHPAO1),利用其高催化效率、廣泛基質特異性以及對氧不敏感的特性,探討 P. aeruginosa PAO1之葡萄糖去氫化酶作為生物燃料電池的陽極觸媒的可能性。利用 1.5 % Triton X-100洗出位於細胞膜上的葡萄糖去氫化酶以 DEAE Sepharose陰離子交換樹脂管柱進行分離純化,結果指出 P. aeruginosa PAO1存有二種以複合體型態存在的葡萄糖去氫化酶。將所純化的葡萄糖去氫化酶以定電位法進行分析,於固定電壓 0.35 V下,兩種型態的葡萄糖去氫化酶每一單位分別可產生 1814 ?嫀/cm2、2748 ?嫀/cm2的電流密度。此結果顯示 P. aeruginosa PAO1的葡萄糖去氫化酶做為生物燃料電池的陽極酵素,是相當具有發展潛力的。
Biofuel cells are miniature power-generating systems that convert chemical energy to electrical energy by using biocatalysts to catalyze the oxidation of organic substances. Glucose dehydrogenase is an ideal anodic catalyst for biofuel cells because of its high catalytic efficiency, wide substrate specificity and insensitivity to oxygen. It is inherently limited to improve the efficiency of the biofuel cell system by enzyme modifications, immobilizations and electrodes modifications. To overcome these limitations, a powerful anode catalyst is essential. The glucose dehydrogenase in the membrane was washed by 1.5 % Triton X-100. Two types of glucose dehydrogenase in Pseudomonas aeruginosa PAO1 were co-purified by the DEAE sepharose chromatography, and existed in the form of complex. The activity of the glucose dehydrogenase was determined by dye-reduction method during the purification processes. By constant-potential method at 0.35 V and 25 ℃, using Ag/AgCl as a reference, one unit of GDHA and GDHB had a current density of 1814 ?嫀/cm2 and 2748 ?嫀/cm2, respectively. Compared with the current density of glucose oxidase of Aspergillus niger, the glucose dehydrogenase of P. aeruginosa PAO1 was a potential anodic catalyst in biofuel cell system.
目錄
封面內頁 頁次
中文摘要 …………………………………………………………………..I
英文摘要 ………………………………………………………………….Ⅱ
誌謝 ………………………………………………………………………Ⅲ
目錄 ………………………………………………………………………Ⅳ
表目錄 ……………………………………………………………………Ⅵ
圖目錄 ……………………………………………………………………Ⅶ

第一章 文獻回顧 …………………………………………………….……1
1. 1 燃料電池 ……………………………………………………….…..1
1. 2 生物燃料電池 ………………………………………………….…..2
1. 3 葡萄糖去氫化酶與生物燃料電池 …..…………………………….…..2
1. 4 Pseudomonas aeruginosa PAO1 ……………………………….……6
1. 5 電分析化學測定方式 ………………………….…………………..6
第二章 實驗目的與範疇 ……………………………………………….…8
第三章 材料與實驗方法 …………………………………………….…..10
3.1 菌種 …………………………………………………………….….10
3.2 培養基 ………………………………………………………….….10
3.3 樂品 …………………………………………………………….….10
3.4 電極的製作與使用 …………………………………………….….11
3.5 電化學測定 …………………………………………………….….11
3.6 P. aeruginosa PAO1的培養 …………...……………………….….12
3.7 葡萄糖去氫化酶的膜蛋白粗萃取液製備 …………………….…12
3.8 葡萄糖去氫化酶 (glucose dehydrogenase, GDH)活性測定 ….…23
3.9 蛋白質濃度的測定 ………………………………………………..14
3.10 SDS聚丙醯胺膠體電泳法 (SDS ployacrylamide gel electrophoresis) ……………………………………………………14
3.11 Nondenaturing聚丙醯胺膠體電泳法 (Nondenaturing ployacrylamide gel electrophoresis) ……………………………….14
3.12 蛋白質凝膠電泳的染色 …………………………………………15
3.13 以製備型電泳槽 (Preparative Cell)純化蛋白質 ……………….16
3.14 以密度梯度離心技術分離蛋白質 ………………………………16
第四章 結果 ……………………………………………………………...17
4.1 葡萄糖去氫化酶的粗純化程序的建立 …………………………..17
4.2 GDHPAO1粗萃取液的生理特性與酵素動力學之探討GDHPAO1與 cofactor PQQ、Ca2+及 Mg2+的關係 ………………………………19
4.3 GDH的純化與鑑定 ………………………………………………..21
4.3.1 鹽析 (Salting out) ………………………………………………..22
4.3.2 以製備型電泳槽 (Preparative Cell)分離 GDHPAO1 ……………22
4.3.3 梯度離心技術分離 GDHPAO1 ...…………………………………24
4.3.4 以 DEAE sepharose管柱進行 GDHPAO1的純化 ………………25
4.3.5 以 Sephacryl S-200 HR管柱層析進行 GDHPAO1的純化 ……..28
4.4 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption inoization-time of flight mass spectrometer)質譜分析 ……………………..…………28
第五章 討論 ……………………………………………………………...31
第六章 結論 ……………………………………………………………...36
參考文獻 ………………………………………………………………….73
附錄 ……………………………………………………………………….76


表目錄
頁次
表 1.1 PQQ-depenent enzyme於不同菌種中的分類 …………………37
表 4.1 以不同處理條件所獲得 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液之 Specific Activity (U/mg) ………………………………………..38
表 4.2 分離純化過程中每一步驟所獲得的 GDHPAO1溶液之 Specific Activity之比較 ………………………………………………...38
表 4.3 利用 MALDI-TOF質譜技術分析圖 4.35中編號所指示的蛋白質 ………………………………………………………………..39


















圖目錄
頁次
圖 1.1 PEM燃料電池之機制示意圖 …………………………………..40
圖 1.2 燃料電池的分類 ………………………………………………..40
圖 1.3 生物燃料電池之電子傳遞示意圖 ……………………………..41
圖 1.4 四種 o-quinone cofactor的化學結構 …………………………..42
圖 1.5 循環伏安圖及相對之Fe(CN)64-[-] / Fe(CN)63-[--]濃度分佈 ...42
圖 3.1 利用K3Fe(CN)6溶液測試玻璃碳化電極之標準CV曲線圖 …43
圖 3.2 鉑電極於 1 N硫酸水溶液之標準 CV圖 …………………….43
圖 3.3 銀/氯化銀參考電極之處理流程圖 …………………………….44
圖 3.4 電化學測定之裝置圖 …………………………………………..44
圖 3.5 DCIP dye-reduction活性測定原理 …………………………….45
圖 3.6 製備型電泳槽 (Preparative Cell)的裝置圖 …………………...46
圖 4.1 cofactor PQQ及Ca2+、Mg2+對GDHPAO1對的影響 ………….47
圖 4.2 在25 ℃下以 DCIP測定方式分析 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的Km值 …………………………………………………………48
圖 4.3 測定 GDHPAO1 膜蛋白粗萃取液不同糖類的選擇性 ..……….49
圖 4.4 利用DCIP活性測定方式測試 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的最佳反應溫度 ……………………………………………………….50
圖 4.5 於 25 ℃下利用 DCIP活性測試方式測定 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的反應最佳 pH值 …………………………………….50
圖 4.6 在 25 ℃下以 DCIP測試方式分析 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的濃度與電子傳遞速率之關係 ………………………………51
圖 4.7 利用定電位法分析 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的濃度與電流密度之關係 ……………………………………………………….51
圖 4.8 利用定電位法分析 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液對 glucose的 Km ………………………………………………………………52
圖 4.9 利用不同濃度的 Triton X-100處理 GDHPAO1粗萃取液所獲得的蛋白質表現情形 …………………………………………….53
圖 4.10 利用 Native PAGE分析 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液中GDHPAO1的表現情形 …………………………………………………….54
圖 4.11 將 Native PAGE (圖 4.10)上訊號位置的膠體切下,利用 SDS PAGE分析訊號區之蛋白質的分子量分佈 …………………55
圖 4.12 比較不同pH之 separating gel所製作的 Native PAGE對 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液分離效果的影響 …………………56
圖 4.13 以DCIP活性測定方式分析利用填充Native gel之製備型電泳槽分離蛋白質之效果 ………………………………………...56
圖 4.14 利用Native PAGE分析利用填充Native gel之製備型電泳槽分離GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的效果 ………………………..57
圖 4.15 以填充Native gel之製備型電泳槽分離 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的結果 …………………………………………………...57
圖 4.16 利用 DCIP測定方式及定電位法分析以梯度離心法分離 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的結果 ……………………………58
圖 4.17 利用 Native PAGE分析以梯度離心法分離 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的結果 ………………………………………………...59
圖 4.18 利用SDS PAGE分析以梯度離心法分離 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的結果 …………………………………………………...59
圖 4.19 利用DEAE sepharose管柱層析法分離 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液於 FPLC的分析圖 ……………………………………….60
圖 4.20 利用 DEAE sepharose管柱層析分離 GDHPAO1膜蛋白粗萃取液所得的活性蛋白質分佈情形 ……………………………..61
圖 4.21 以 DEAE sepharose管柱層析分離GDHPAO1膜蛋白粗萃取液的結果 …………………………………………………………..61
圖 4.22 在 25℃下以 DCIP測定方式分析 GDHA、GDHB 對不同糖類的 Km …………………………………………………………62
圖 4.23 GDHA、GDHB對不同糖類的選擇性 …………………………62
圖 4.24 利用 DCIP測試方式分析GDHA、GDHB及membrane crude extract最佳反應之 pH ………………………………………..63
圖 4.25 GOx於 25 ℃下的 CV曲線圖 ………………………………64
圖 4.26 利用循環伏安法觀察 GOx於 25 ℃下添加 glucose後於電極表面形成電阻的情形 ………………………………………...65
圖 4.27 利用 K3Fe(CN)6的 CV曲線圖觀察 GOx反應前後電極表面的現象 …………………………………………………………...65
圖 4.28 GDHA於 25℃下的 CV曲線圖 ……………………………..66
圖 4.29 利用循環伏安法觀察 GDHA於 25 ℃下添加 glucose後於電極表面形成電阻的情形 ……………………………………...66
圖 4.30 GDHB於 25 ℃下的 CV圖 …………………………………67
圖 4.31 利用循環伏安法觀察 GDHB於 25 ℃下添加 glucose後於電
極表面形成電阻的情形 …….………………………………..67
圖 4.32 利用 K3Fe(CN) 6的 CV曲線圖觀察 GDHA及 GDHB反應前後電極表面的現象 ……………………………………………...68
圖 4.33 以時間安培法測試 GDHA、GDHB對不同糖類的選擇性….....69
圖 4.34 以時間安培法測試 GDHA、GDHB最佳反應溫度………….....69
圖 4.35 利用 Sephacryl S-200 HR管柱層析分離 GDHB溶液於 FPLC分析圖 ………………………………………………………...70
圖 4.36 以 Sephacryl S-200 HR管柱層析分離 GDHB溶液的結果 .71
圖 4.37 以 10 % SDS PAGE分析 GDHA (道 1)、GDHB (道 2)的結果 ……………………………………………………………...71
圖 4.38 MALDI-TOF質譜分析結果顯示 84 kDa的蛋白質為
P. aeruginosa PAO1的 GCD。紅色的部份為比對到相同的胺基酸序列 ……………………………………………………...72
圖 4.39 MALDI-TOF質譜分析的結果顯示 40 kDa的蛋白質為 P. aeruginosa PAO1的 GCD。紅色的部份為比對到相同的胺基酸序列 ……………………………………………………...72
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1. 10.黃異,〈論漁業經營之管理制度及漁業徵收與補償〉,收錄於《政大法學評論》第38期,民國77年12月。
2. 10.黃異,〈論漁業經營之管理制度及漁業徵收與補償〉,收錄於《政大法學評論》第38期,民國77年12月。
3. 10.黃異,〈論漁業經營之管理制度及漁業徵收與補償〉,收錄於《政大法學評論》第38期,民國77年12月。
4. 4.李建良,〈基本權利理論體系之構成及其思考層次〉,收錄於《人文及社會科學集刊》第九卷第一期,民國86年。
5. 4.李建良,〈基本權利理論體系之構成及其思考層次〉,收錄於《人文及社會科學集刊》第九卷第一期,民國86年。
6. 4.李建良,〈基本權利理論體系之構成及其思考層次〉,收錄於《人文及社會科學集刊》第九卷第一期,民國86年。
7. 1.王志文,國際法上海洋漁業資源之開發與養護,華岡法粹,民國88年12月。
8. 1.王志文,國際法上海洋漁業資源之開發與養護,華岡法粹,民國88年12月。
9. 1.王志文,國際法上海洋漁業資源之開發與養護,華岡法粹,民國88年12月。
10. 13.楊松齡,財產權保障與公用徵收補償之研究,經社法制論叢,第九期,民國81年1月。
11. 13.楊松齡,財產權保障與公用徵收補償之研究,經社法制論叢,第九期,民國81年1月。
12. 13.楊松齡,財產權保障與公用徵收補償之研究,經社法制論叢,第九期,民國81年1月。
13. 15.歐慶賢,日本漁業權制度與漁業補償制度,漁業推廣,民國80年10月。
14. 15.歐慶賢,日本漁業權制度與漁業補償制度,漁業推廣,民國80年10月。
15. 15.歐慶賢,日本漁業權制度與漁業補償制度,漁業推廣,民國80年10月。