臺灣博碩士論文加值系統

凝血酶原時間(prothrombin time, PT)是一種常見的血液檢測，被當作需要口服抗凝劑(oral anticoagulant therapy, OAT)患者用藥量的評估指標。若服用過多的抗凝劑，則會因為凝血時間延長造成出血的危險；服用太少的抗凝劑則容易使血液凝結而阻塞血管，導致中風甚至有生命的危險。因此，若能發展可攜式凝血酶原時間測定儀器，提供臨床工作者或患者做即時凝血時間的測量，將可有效監控患者的凝血狀態，提高其存活機率。
本研究利用微流體光碟中簡單的微流道設計，整合馬達控制與光學儀器測量技術建立了一套重點看護(Point-of-Care，POC)儀器，測量乾式試劑與濕式試劑的凝血酶原時間並將同樣品的檢測結果與Sysmex CA-500檢測結果比較關聯性。實驗結果顯示乾式試劑與濕式試劑均有不錯的測試重現性。然而固相試劑凝血酶原時間比液相試劑凝血酶原時間長，經過各項實驗探討，發現原因有三個：(1)PT試劑在冷凍乾燥過程中其活性被破壞。(2)在微流體碟片中血漿與PT試劑混合效率較差，將來需要改變微流道設計來增加混合效率。(3)試劑對血漿的溶解度也有影響。

Prothrombin Time (PT) test is a sensitive monitoring test for oral anticoagulant therapy. Patients with heart and other diseases may take blood-thinning drugs to prevent clotting. These drugs have a “narrow” therapeutic range; Too much blood thinner can cause hemorrhage, while too little can allow clots to form and obstruct blood vessels, causing stroke or death. Patients taking oral anticoagulant therapy usually had a PT test every one or two months during the regular visit to their doctors. By using an in-home test kit, they can test themselves as often as their doctors recommended.
In this research project, a point-of-care PT test on a microfluidic disc analyzer is developed with the integration of motor control, optical property measurement and microchannels. Both dry and wet reagent methods were conducted and the test results were compared with the ones measured by Sysmex CA-500. The experimental results showed good repeatability for both methods. However, the experimental results also showed that the prothrombin time measured by the dry reagent method is longer than the wet reagent method. The reason for this deviation was discussed and it was found that the activity of the dry reagent, the mixing efficiency in the microchannel and the solubility of the PT reagent play important roles on the extension of the prothrombin time.

致 謝 i
摘 要 ii
Abstract iii
第一章 緒 論 1
1.1 Point-of-Care Testing (POCT) 1
1.2 微型全分析系統(Micro total analysis systems, μTAS) 2
1.3 微流體光碟(Microfluidic disc) 5
1.4 凝血酶原時間(Prothrombin Time, PT) 14
1.5 研究動機 16
第二章 文獻回顧 17
2.1 常見血液凝固測試 17
2.2 凝血路徑 18
2.2.1 外因型路徑(Extrinsic Coagulation Pathway) 18
2.2.2 內因型路徑(Intrinsic Coagulation Pathway) 19
2.2.3 共同凝血路徑(Common Coagulation Pathway) 19
2.3 PT測量方法 20
2.3.1 影響PT之變因 21
2.3.2國際標準化凝血酶原時間比值(International Normalized Ratio，INR) 21
2.4 偵測原理 24
2.4.1 散射比濁法 24
2.4.2 透射比濁法 25
2.4.3 黏度法 26

第三章 實驗內容 29
3.1實驗物品 29
3.1.1藥品與材料 29
3.1.2 實驗物品製備流程 29
3.2 實驗裝置設計 32
3.2.1 微流體光碟製作 32
3.2.2 硬體設計 37
3.2.3 軟體設計 39
3.2.4 光感應器 40
3.3 實驗步驟 42
3.3.1 濕式試劑 PT反應流程 42
3.3.2 乾式試劑 PT反應流程 42
第四章 實驗結果與討論 43
4.1 實驗參數討論 43
4.1.1 偵測方法 43
4.1.2 分光光度計 44
4.2 穩定性測試 46
4.2.1 濕式試劑 PT 46
4.2.2 乾式試劑 PT 47
4.2.3 與Sysmex CA-500之PT結果比較 48
4.3 冷凍乾燥PT延長之探討 49
4.3.1冷凍乾燥對PT試劑活性之影響 49
4.3.2 冷凍乾燥過程中PT試劑的水分減少濃度改變影響 50
4.3.3 在微通道中溶解速率對PT之影響 51

4.3.4 混合方式影響 52
4.4 結果討論 54
4.5 未來展望 56
參考文獻 57

圖目錄
圖一 微流體晶片 3
圖二 Gyros Bioaffy® CD microlaboratory 6
圖三 Microstructures of Gyros Bioaffy® CD 6
圖四 Gyrolab Workstation LIF 7
圖五 在微流體碟片上進行細胞培養(from Gyros AB) 7
圖六 Abaxis Reagent Disc 8
圖七 Abaxis Piccolo® System 9
圖八 Abaxis Vetscan® Classic System 9
圖九 Abaxis Vetscan® VS2 System 10
圖十 Tecan LabCD-ADMET System 10
圖十一 Maxwell Sensors MCL Microfluidic Disc 11
圖十二 ELISA步驟 11
圖十三 BioLOC™ CD-ELISA 12
圖十四 利用離心力驅動流體示意圖 13
圖十五 美國POCT市場預估圖(from Roche Diagnostic) 14
圖十六 INR與死亡人數關係統計 15
圖十七 凝血路徑 18
圖十八 基本PT測量流程圖 20

圖十九 自有系統的ISI校正一 23
圖二十 自有系統的ISI校正二 23
圖二十一 OAT therapeutic range 24
圖二十二 散射比濁法 25
圖二十三 透射比濁法 25
圖二十四 磁珠法 26
圖二十五 PQC凝血時間曲線 27
圖二十六 使用SPR測量血液凝固時間 27
圖二十七 使用SPR測量PT結果 28
圖二十八 音波法測量凝血時間 28
圖二十九 水之三相圖 30
圖三十 冷凍乾燥機 EYELA FDU-2100 31
圖三十一 冷凍乾燥後的PT試劑粉末 32
圖三十二 微流體光碟製作過程 33
圖三十三 濕式試劑 PT碟片設計圖 34
圖三十四 乾式試劑 PT 碟片設計圖 34
圖三十五 測溶解度影響用之碟片設計圖 35
圖三十六 切割機 35
圖三十七 護貝機 36
圖三十八 雕刻機 36
圖三十九 實驗裝置示意圖 37
圖四十 實驗裝置圖-馬達控制 38
圖四十一 實驗裝置圖-偵測系統 38
圖四十二 軟體介面 39

圖四十三 濕式試劑凝血酶原時間實驗流程 40
圖四十四 乾式試劑凝血酶原時間實驗流程 40
圖四十五 全自動校正模式 41
圖四十六 雙點校正模式 41
圖四十七 散射比濁法結果 43
圖四十八 透射比濁法結果 44
圖四十九 濕式試劑PT穩定性 46
圖五十 濕式試劑 PT 46
圖五十一 乾式試劑PT穩定性 47
圖五十二 乾式試劑 PT 47
圖五十三 與Sysmex CA-500 PT結果之關聯性(濕式試劑PT) 48
圖五十四 與Sysmex CA-500 PT結果之關聯性(乾式試劑PT) 48
圖五十五 冷凍乾燥對PT試劑活性之影響 49
圖五十六 水分轉移對PT之影響 51
圖五十七 溶解度實驗示意圖 51
圖五十八 溶解度對PT之影響 52
圖五十九 混合方式對PT時間之影響實驗示意圖 53
圖六十 混合方式對PT之影響 53

表目錄
表一 μTAS相關研究 3
表二 分光光度計參數 45
表三 血漿與PT試劑之濃度與體積關係表 50


公式目錄
式一 壓差與半徑之關係 13
式二 INR計算公式 22

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