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研究生:陸崇軒
研究生(外文):Lu Chung-Hsuan
論文名稱:利用攪拌式流體化床吸附技術從非澄清菌液中直接回收增強型綠色螢光蛋白
論文名稱(外文):Direct recovery of enhanced green fluorescent protein from unclarified Escherichia coli homogenate by using stirred fluidzied bed adsorption technique
指導教授:張煜光張煜光引用關係劉昭麟劉昭麟引用關係
指導教授(外文):Chang Yu-KaungLiu Chao-Lin
學位類別:碩士
校院名稱:明志科技大學
系所名稱:生化工程研究所
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2007
畢業學年度:95
語文別:中文
論文頁數:105
中文關鍵詞:增強型綠色螢光蛋白Langmuir 方程式攪拌型流體化床層析管柱非澄清細胞破碎菌體溶液
外文關鍵詞:EGFPLangmuir modelSTREAMLINE DEAEStirred fluidized bedUnclarified E. coli homogenates
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應用新型之純化程序攪拌式流體化床吸附技術,從非澄清大腸桿菌液中直接回收基因重組之增強型綠色螢光蛋白 (enhanced green fluorescent protein;EGFP),並選用商業化 STREAMLINE DEAE 樹脂在 20mM 甘胺酸緩衝溶液 (pH9.0) 為最佳吸附操作條件。而此吸附之模式符合典型等溫吸附曲線,並可利用 Langmuir 方程式求得樹脂對 EGFP 之最大吸附量與解離常數,分別為 6.3mg/ ml 及 1.3x10-3 mg/ ml。且在一系列固定床及澄清菌液系統的操作條件下,尋找最佳沖提條件,而利用 0.2 M 氯化鹽類溶液 (pH9.0) 作為沖提溶液,在 10 倍床體積,操作流速為 200 cm/hr 的沖提條件下,EGFP 的回收率可達 93% 。接著再將最佳吸附與沖提條件應用於攪拌式流體化床層析管柱,並評估在不同進料體積之非澄清細胞破碎菌體溶液 (50-200 ml) 中直接回收 EGFP 之可行性。結果顯示,三種不同進料體積之非澄清細胞破碎菌體溶液,在單一步驟純化程序,攪拌速率為 200 rpm 時,EGFP 的純化回收率可高達 95-98% 而純度提升約 3 倍。
An improved procedure was developed involving a stirred fluidized bed (SFB) adsorption for direct recovery of recombinant enhanced green fluorescent protein (EGFP) from unclarified E. coli homogenates. The maximal binding capacity of STREAMLINE DEAE adsorbent for EGFP was observed at pH 9. A typical adsorption isotherm curve for EGFP in a crude E. coli homogenate was well correlated with the Langmuir model. The maximal binding capacity for EGFP and dissociation constant for EGFP-adsorbent complex were 6.3mg/ ml and 1.3x10-3 mg/ ml respectively. Optimal conditions for elution scheme were further determined in small packed bed experiments conducted with clarified E.coli homogenate under the various operating conditions. The recovery yield for the EGFP was approximately 93% by using 0.2 M NaCl (pH 9) and 10 fold adsorbent volumes at liquid velocity of 200 cm/h. The operating conditions were chosen for use in further purification process. Finally, the experiments were carried out to assess the feasibility of using SFB chromatography for direct recovery of EGFP from different loading volumes (50-200 ml) of highly crude E.coli homogenate (pH 9). It was found to be successful in achieving purification of EGFP in a high yield of 95-98% and the purification factor was approx. 3 in a single step under these loading volumes of E. coli homogenates at a rotating speed of 200 rpm.
目錄
明志科技大學碩士學位論文指導教授推薦書 i
明志科技大學碩士學位論文口試委員審定書 ii
明志科技大學學位論文授權書 iii
誌謝 iv
中文摘要 v
英文摘要 vi
目錄 vii
圖表目錄 xii
縮寫對照表 xvii
符號表 xviii
第一章 緒論與文獻回顧 1
1.1. 生物發光 1
1.2. 綠色螢光蛋白 1
1.2.1. 綠色螢光蛋白的結構 2
1.2.2. 綠色螢光蛋白的發光機制 3
1.2.3. 綠色螢光蛋白的突變體 3
1.2.4. 綠色螢光蛋白的穩定性 4
1.2.4.1. GFP對溫度的敏感性 4
1.2.4.2. GFP 對酸鹼值的耐受性 4
1.2.4.3. GFP 對蛋白質變性試劑的耐受性 5
1.2.5. 綠色螢光蛋白的純化 5
1.2.6. 綠色螢光蛋白的應用 5
1.2.7. 螢光蛋白的應用與商業化 6
1.2.7.1. 螢光蛋糕 6
1.2.7.2. 螢光魚 6
1.3. 蛋白質純化 6
1.3.1. 管柱層析法 7
1.3.1.1. 膨脹床層析管柱 7
1.3.1.2. 攪拌式流體化床層析管柱 8
1.3.2. 離子交換樹脂 8
1.3.3. 複合型樹脂 9
1.4. 實驗目的 9
第二章 實驗材料與方法 14
2.1. 實驗材料 14
2.1.1. 藥品 14
2.1.2. 質體 15
2.1.3. 酵素 15
2.1.4. 抗體 16
2.1.5. DNA 操作試液套組 16
2.1.6. 標準分子量溶液 16
2.2. 實驗設備 17
2.3. 增強型綠色螢光蛋白EGFP與His/EGFP基因選殖與表現 20
2.3.1. 引子設計 20
2.3.2. 聚合酶連鎖反應 20
2.3.3. 洋菜膠電泳分析 20
2.3.4. DNA之回收 21
2.3.5. 腺嘌呤核苷酸偶合反應 21
2.3.6. pCRRII-TOPO 載體的接合反應 21
2.3.7. 勝任細胞的製備 22
2.3.8. 細菌轉型作用 22
2.3.9. 細菌質體 DNA 的抽取 22
2.3.10. His/pET-15b-EGFP 基因質體構築 23
2.3.11. 接合反應 23
2.3.12. 限制酶檢視 24
2.3.13. pET-15b-EGFP 基因質體構築 24
2.3.14. IPTG 誘導重組蛋白的產生 24
2.3.15. 硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳法 25
2.3.16. 西方墨點法 27
2.3.17. 總量蛋白質定量分析(檢量線製作) 29
2.3.18. 菌液中總量蛋白質分析 29
2.3.19. 螢光定量分析(檢量線製作) 30
2.3.20. 菌液中螢光活性分析 30
2.4. 增強型綠色螢光蛋白質搖瓶培養條件篩選 30
2.4.1. 菌株 30
2.4.2. 培養基組成 30
2.4.2.1接種菌平板培養基 31
2.4.2.2批次發酵培養基 31
2.4.3. 搖瓶培養基之選用 31
2.4.4. 不同pH 效應 32
2.4.5. 不同碳源濃度效應 32
2.4.6. 不同溫度誘導效應 32
2.5. 增強型綠色螢光蛋白質生產 33
2.5.1 培養基滅菌 33
2.5.2 E. coli BL21(DE3) / pET-15b-EGFP 批次發酵培養 33
2.5.3 E. coli細胞破碎 33
2.6. 增強型綠色螢光蛋白質純化程序 34
2.6.1緩衝溶液之配置 34
2.6.2 HST 複合性樹脂對 EGFP 的最適吸附 pH 選擇 34
2.6.3 DEAE 樹脂對 EGFP 的最適吸附 pH 選擇 35
2.6.4 DEAE 樹脂對 EGFP 吸附速率探討 35
2.6.5 DEAE 樹脂對 EGFP 等溫吸附行為探討 35
2.6.6 DEAE 樹脂對EGFP 沖提條件的選擇 36
2.6.6.1氯化鈉鹽類之效應 (批次法) 36
2.6.6.2氯化鈉鹽類之效應 (管柱法) 37
2.6.6.3沖提流速與體積之效應 (管柱法) 37
2.6.7從未澄清破碎菌體溶液中純化 EGFP 之直接回收程序 38
2.6.7.1未澄清破碎菌液的進料體積(50ml) 38
2.6.7.2未澄清破碎菌液的進料體積(100ml) 39
2.6.7.3未澄清破碎菌液的進料體積(200ml) 40
第三章 結果與討論 43
3.1. 增強型綠色螢光蛋白基因選殖與表現 43
3.1.1 增強型綠色螢光蛋白基因序列的增幅 43
3.1.2 綠色螢光蛋白的基因選殖 43
3.1.3 His/pET-15b-EGFP表現質體的構築 43
3.1.4 pET-15b-EGFP表現質體的構築 44
3.1.5 重組His/pET-15b-EGFP的小量表現 45
3.1.6 重組 His/pET-15b-EGFP 的西方墨點法 45
3.1.7 重組pET-15b-EGFP的小量表現 46
3.1.8 重組pET-15b-EGFP的西方墨點法分析 46
3.2 增強型綠色螢光蛋白質培養與生產 57
3.2.1培養基選用 57
3.2.2不同pH值效應 58
3.2.3不同碳源濃度效應 59
3.2.4誘導溫度效應 61
3.2.5 E. coli細胞破碎 62
3.3 增強型綠色螢光蛋白質純化 65
3.3.1樹脂對 EGFP 最適吸附條件之探討 65
3.3.2樹脂對 EGFP 吸附速率之探討 69
3.3.3樹脂對 EGFP 等溫吸附行為之探討 70
3.3.4樹脂對 EGFP 沖提條件之選擇 74
3.3.4.1氯化鈉鹽類之效應 74
3.3.4.2沖提流速之效應 76
3.3.4.3沖提體積之效應 76
3.3.5從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序 78
3.3.5.1未澄清破碎菌液的進料體積 (50 ml) 78
3.3.5.2未澄清破碎菌液的進料體積 (100 ml) 80
3.3.5.3未澄清破碎菌液的進料體積 (200 ml) 83
3.3.5.4攪拌式流體化床操作程序 86
3.3.6 EGFP 純化程序之比較 88
第四章 結論與展望 90
參考文獻 98

圖表目錄
圖1-1:The bioluminescent pathway in Aequorea 10
圖1-2:EGFP 結構圖 11
圖1-3:攪拌式流體化床層析管柱 12
圖1-4:STREAMLINE DEAE 樹脂結構圖 13
圖1-5:STREAMLINE Direct HST 樹脂結構圖 13
圖2-1:EGFP、His/EGFP之基因選殖與表現示意圖 19
圖2-2:攪拌式流體化床吸附程序示意圖 41
圖2-3:攪拌式流體化床層析管柱 42
圖3-1:以設計之引子進行 PCR 選殖 47
圖3-2:以限制酶水解反應鑑定TOPO vector的接合作用 48
圖3-3:EGFP 基因片段取得 49
圖3-4:以限制酶酵素水解表現載體 pET-15b 50
圖3-5:以限制酶水解反應鑑定His-pET-15b-EGFP的接合作用 51
圖3-6:以限制酶水解His-pET-15b-EGFP 載體 52
圖3-7:以 IPTG 誘導 E-coli BL21 於胞内生產重組蛋白 EGFP 53
圖3-8:以 Anti-6×His tag 抗體對 His/EGFP 進行西方墨點分析 54
圖3-9:以 IPTG 誘導 E-coli BL21 於胞内生產重組蛋白 EGFP 55
圖3-10:以 Anti-GFP 之抗體對 EGFP 進行西方墨點分析 56
圖3-11:LB、M9 medium 對 EGFP 及 total protein 生產的比較 57
圖3-12:培養基起始 pH 對 EGFP 及 total protein 生產的影響 58
圖3-13:不同濃度 Glucose 對 EGFP 及 total protein 生產的影響 60
圖3-14:不同濃度 Glycerol 對 EGFP 及 total protein 生產的影響 60
圖3-15:不同碳源對 EGFP、total protein 及 螢光比活性的影響 61
圖3-16:不同誘導溫度對 EGFP 及 total protein 生產的影響 62
圖3-17:高壓破菌循環次數對蛋白質釋放量的影響 64
圖3-18:總量蛋白質定量分析圖 64
圖3-19:螢光定量分析圖 65
圖3-20:pH 值對 EGFP 螢光強度表現的影響 68
圖3-21:HST 樹脂在不同 pH 值對 EGFP 及 total protein 的吸附量之比較 68
圖3-22:DEAE 樹脂在不同 pH 值對 EGFP 及 total protein 的吸附量之比較 69
圖3-23:DEAE 樹脂對 EGFP及total protein 吸附速率之比較 70
圖3-24:DEAE 樹脂對 EGFP 等溫吸附曲線 72
圖3-25:DEAE 樹脂對 total protein 等溫吸附曲線 72
圖3-26:DEAE 樹脂對 EGFP 等溫吸附線性關係 73
圖3-27:DEAE 樹脂對 total protein 等溫吸附線性關係 73
圖3-28:不同鹽類濃度對 EGFP及total protein 脫附累積百分率之比較(批次法) 75
圖3-29:不同鹽類濃度對 EGFP及total protein 脫附累積百分率之比較(管柱法) 75
圖3-30:不同流速與沖提體積對 EGFP 脫附累積百分率之比較 77
圖3-31:不同流速與沖提體積對 total protein 脫附累積百分率之比較 77
圖3-32:從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序(進料體積 50 ml) 80
圖3-33:從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序(進料體積 100 ml) 83
圖3-34:從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序(進料體積 200 ml) 86
圖3-35:攪拌式流體化床層析管柱操作程序流程圖 87
表 2-1:不同濃度SDS-聚丙烯醯胺凝膠配置表 27
表 3-1:從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序(進料體積 50 ml) 79
表 3-2:從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序(進料體積 100 ml) 82
表 3-3:從未澄清破碎菌體溶液中對 EGFP 直接回收程序(進料體積 200 ml) 85
表 3-4:近年來 EGFP 純化程序之比較 89
附錄一:EGFP 基因全長序列 92
附錄二:EGFP 等電點與分子量的理論值 93
附錄三:pET-15b-EGFP 質體圖譜 94
附錄四:His-pET-15b-EGFP 質體圖譜 95
附錄五:pIRES-EGFP 質體圖譜 96
附錄六:pET-15b質體圖譜 97
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