臺灣博碩士論文加值系統

氧化低密度脂蛋白被視為心血管疾病的致病原因，而氧化磷脂膽鹼 ( ox-PC )是氧化低密度脂蛋白 ( ox-LDL ) 上重要的成分，所以氧化磷脂膽鹼逐漸受到研究者重視。本研究為利用毛細管區帶電泳 ( CZE ) 分離在體外氧化的磷脂膽鹼，並且找出最佳條件來進行氧化磷脂膽鹼的分離鑑定，因此我們選用一個為水相 ─ 有機溶劑相的系統來當電解緩衝溶液，此電解緩衝溶液中包含了10%磷酸鈉緩衝溶液 ( pH值為7.4 , 最後濃度為5mM ) 加上80%甲醇和10%乙腈，此電解緩衝溶液可得分離程度最好的氧化磷脂膽鹼。另外本實驗也討論維他命C會抑制磷脂膽鹼氧化的作用；以及使用20%磷酸鈉緩衝溶液 ( pH值為7.4 , 最後濃度為5mM ) 加上70%甲醇和10%乙腈當電解緩衝溶液，測定C反應蛋白在含鈣離子的樣品溶液中，會和氧化磷脂膽鹼鍵結，但C反應蛋白不會和未氧化磷脂膽鹼反應。

The oxidized low density lipoprotein is plays causative role in cardiovascular disease, then oxidized phosphatidylcholine (ox-PC) which is important composed of oxidized low density lipoprotein (ox-LDL), therefore research workers to attach importance to oxidized low density lipoprotein gradually. In this study, capillary zone electrophoresis (CZE) was used to determine oxidized phosphatidylcholine (ox-PC) in vitro, and fined optimize conditions to separation oxidized phosphatidylcholine, hence, we choose the electrolysis buffer is an aqueous–organic solvent system containing 10% sodium phosphate buffer ( pH=7.4 , 5mM ) + 80% methanol + 10% acetonitrile, which is good degree of separated oxidized phosphatidylcholine . Further, our study to discuss that vitamin C is inhibited on the oxidation of phosphatidylcholine , as well as , the electrolysis buffer is 20% sodium phosphate buffer ( pH=7.4 , 5mM ) + 70% methanol + 10% acetonitrile, C-reactive protein bonding with oxidized phosphatidylcholine in the sample solution to contain calcium ion and did’t reactived with phosphatidylcholine.

第一章. 粥狀動脈硬化(Atherosclerosis) 1
第一節.介紹粥狀動脈硬化(Atherosclerosis)的形成 1
第二章. 脂蛋白上磷脂質介紹 3
第一節.脂蛋白(lipoprotein) 3
第二節.磷脂質(phospholipids) 5
第三節.磷脂膽鹼(phosphatidylcholine,PC) 7
第四節.C反應蛋白影響氧化磷脂膽鹼 8
第三章. 毛細管電泳 10
第一節.毛細管電泳發展 10
第二節.毛細管電泳原理 10
一.電泳 10
二.電滲透流 11
三.電泳遷移率(Electrophoretic mobility,µe) 13
四.毛細管電泳的偵測 14
五.毛細管電泳的應用 15
六.影響分離效率的因素 21
七.毛細管電泳法和各種層析方法的比較 23
第四章. 實驗步驟 25
第一節.藥品來源 25
第二節.配製電解緩衝溶液 26
一.先配置濃度為5mM、pH=7.4的sodium phosphate buffered(PB) 26
二.改變緩衝溶液的組成比例 27
三.配製PAGE電泳所需的緩衝溶液 29
第三節.體外氧化磷脂膽鹼 30
第四節.抗氧化劑影響磷脂膽鹼氧化 30
第五節. C反應蛋白和磷脂膽鹼反應 31
第六節.毛細管電泳測定磷脂膽鹼 31
第七節. PAGE電泳 32
第五章 結果與討論 34
第一節.毛細管電泳分離時的電壓 34
第二節.電解緩衝溶液的最佳條件 36
一.緩衝溶液(磷酸鈉緩衝溶液加甲醇)的比例 37
二.緩衝溶液中加入各式有機修試劑 39
三.緩衝溶液加入乙腈 43
四.緩衝溶液中acetonitrile的比例 44
五.緩衝溶液中固定乙腈比例改變磷酸鈉緩衝液以及甲醇的比例 47
六.緩衝溶液中磷酸鈉緩衝液的濃度 49
七.緩衝溶液的pH值 53
八.注入純水在分析物溶液前 56
第三節.磷脂膽鹼(PC)和氧化磷脂膽鹼(ox-PC)的形式 58
一.磷脂膽鹼和氧化磷脂膽鹼在214nm、234nm的電泳圖 58
二.磷脂膽鹼氧化程度及電泳圖再現性 63
第四節.氧化時間對PC氧化程度影響 65
第五節.維他命C的抗氧化作用 70
第六節.C反應蛋白和氧化磷脂膽鹼的反應 74
一.鈣離子對CRP的作用 74
二.不同電解緩衝溶液對CRP分離的影響 75
三.用20%PB + 70%MeOH + 10%ACN當電解緩衝液對磷脂膽鹼分離 77
四.CRP濃度對反應的影響 80
五.C反應蛋白和磷脂膽鹼的反應 82
六.驗證C反應蛋白和氧化磷脂膽鹼的反應 83
第六章. 結論 85
第七章. References 86

圖1低密度脂蛋白的組成形式。From Biochimica et Biophysica Acta 1488 (2000) 189-210。 4
圖2 磷脂質結構圖。 6
圖3 磷脂膽鹼(PC)的結構圖。 8
圖4 C反應蛋白的結構。From Biochemical and Biophysical Research Communications 329 (2005) 1208–1216 [18] 9
圖5 毛細管電泳儀器簡示圖。 11
圖6 電雙層示意圖。 12
圖7 分析物在電滲透(EOF)和流體動力學壓力下流動的情況。 12
圖8 當電滲流(EOF)存在時，各物種出現的速度。 13
圖9 簡示毛細管區帶電泳。 16
圖10 簡示毛細管等電聚焦。 17
圖11簡示微胞毛細管電泳。 18
圖12 簡示毛細管等速率電泳。 19
圖13 簡示毛細管凝膠電泳。 20
圖14 簡示毛細管電層析。 21
圖15 ox-PC的毛細管電泳圖，設定不同電壓。 36
圖16 ox-PC的毛細管電泳圖，設定不同緩衝溶液(PB+MeOH)的比例。 38
圖17 ox-PC的毛細管電泳圖，PB+MeOH加入各種不同的有機修試劑。 41
圖18 ox-PC的毛細管電泳圖，10%PB+90%MeOH是否加入有機修試劑ACN。 44
圖19 ox-PC的毛細管電泳圖，其條件是改變緩衝溶液中ACN的比例。 46
圖20 ox-PC的毛細管電泳圖，改變緩衝溶液中有PB及MeOH的比例。 48
圖21 ox-PC的毛細管電泳圖，改變緩衝溶液的濃度。 52
圖22 Zata電位和不同濃度的電解緩衝溶液的關係。 53
圖23 ox-PC的毛細管電泳圖，改變緩衝溶液的pH值。 55
圖24 ox-PC的毛細管電泳圖，是否加入純水在注入分析物前。 57
圖25 PC以及ox-PC 在吸收為214nm的電泳圖，以及其放大圖。 60
圖26 PC以及ox-PC 在吸收為234nm的電泳圖，以及其放大圖。 62
圖27 ox-PC在214nm的毛細管電泳圖，改變PC的總氧化時間。 67
圖28 ox-PC在234nm的毛細管電泳圖，改變PC的總氧化時間。 69
圖29 ox-PC在214nm吸收的毛細管電泳圖，改變加入的維他命C濃度。 71
圖30 ox-PC在234nm吸收的毛細管電泳圖，改變加入的維他命C濃度。 73
圖31 CRP在不同樣品溶液中的電泳圖。 75
圖32 CRP在不同電解緩衝溶液中的電泳圖。 77
圖33 PC和ox-PC在TBS含鈣的樣品溶液中，214nm的電泳圖。 78
圖34 PC和ox-PC在TBS含鈣的樣品溶液中，234nm的電泳圖。 79
圖35 ox-PC在TBS(含鈣溶液)改變加入CRP量或濃度的電泳圖。 82
圖36 PC在TBS(含鈣溶液)裡，並加入CRP的電泳圖。 83
圖37 CRP、CRP+ox-PC以及CRP+PC的PAGE電泳圖 84

表1 脂蛋白的各種組成。 3
表2 常見的不飽和脂肪酸。 6
表3 各種磷脂質上的鹼基。 7
表4 電解緩衝溶液為PB及MeOH時的配製方法。 27
表5 電解緩衝溶液加入有機修飾劑的配製方法。 28
表6 電解緩衝溶液增加ACN比例的配製法。 28
表7 緩衝溶液固定ACN比例改變PB和MeOH的比例的配製法。 28
表8 電解緩衝溶液中PB不同pH值的配法。 29
表9 沖提的方法。 32
表10 常用的緩衝溶液。 53
表11 比較PC電泳圖中各面積相比比例。 64
表12 比較ox-PC電泳圖中各面積相比比例。 64

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