臺灣博碩士論文加值系統

日本腦炎(Japanese encephalitis, JE)是台灣地區重要的地方性流行人畜共通傳染病，於1968年後，以鼠腦製備、福馬林去活化之日本腦炎病毒Nakayama病毒株疫苗，提供嬰幼兒全面性預防接種，有效降低日本腦炎病例發生率，但每年仍約有20至30名臨床病例，其中約有四分之一的病例死亡，存活病例中約有一半會留下中樞神經方面後遺症，而且臨床上尚無有效抗日本腦炎病毒藥物可供使用，因此彰顯抗病毒藥物研發重要性。
乳鐵蛋白（lactoferrin）存在於母乳、牛乳及黏膜分泌物中，主要功能為鐵結合蛋白質（iron-binding protein），負責腸道內鐵的運輸，亦與非專一性免疫反應有關，且已經被證實具有抗菌及抗病毒功效。在抗病毒方面，乳鐵蛋白被認為主要是經由貼附至細胞表面的heparan sulfate 或直接與病毒顆粒結合達到阻斷病毒感染。本實驗室及許多文獻都已指出heparan sulfate是日本腦炎病毒進入細胞可能的受體之ㄧ，因此本實驗將探討牛乳鐵蛋白對日本腦炎之抗病毒效力。
實驗結果如下：(一)牛乳鐵蛋白對不同日本腦炎病毒株有抑制感染的效果，這些病毒株包括野生病毒株(CJN-2K、T1P1、CC27)及實驗室馴化病毒株(CJN-L1、CJN-S1、T1P1-L4、T1P1-S1、CC27-L1、CC27-L3、CC27-S6、CC27-S8)；(二) 牛乳鐵蛋白對日本腦炎病毒抑制效果，係與細胞進行交互作用，而非直接與病毒結合；(三)乳鐵蛋白的作用步驟，除了抑制日本腦炎病毒貼附至細胞膜上，亦抑制病毒貼附後進入細胞的感染步驟，包括胞飲作用(endocytosis)及穿透作用(penetration)；(四)在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染的效果中，heparan sulfate扮演重要角色，因為對heparan sulfate親合力較高的CJN-S1病毒株，抑制效果較高；而且在正常表現heparan sulfate的CHO-K1細胞中，抑制效果較明顯；(五) 牛乳鐵蛋白係直接與heparan sulfate結合，而抑制日本腦炎病毒貼附、胞飲及穿透作用；(六)在細胞實驗中，水溶性heparin可以降低牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染的效果；(七)除了與heparan sulfate結合外，牛乳鐵蛋白可能還與未知因子結合，而抑制日本腦炎病毒感染，因為牛乳鐵蛋白對heparan sulfate親合力較低的CJN-L1病毒株，有抑制效果；且在不表現heparan sulfate的CHO-pgsA745細胞中，亦可抑制日本腦炎病毒感染。
本研究證明，牛乳鐵蛋白可以有效抑制日本腦炎病毒感染細胞，但仍需後續動物實驗探討牛乳鐵蛋白是否具有保護效果；亦可利用牛乳鐵蛋白可能與未知非子結合，而抑制日本腦炎病毒感染的特性，研究日本腦炎病毒於細胞膜上的受體。

Japanese encephalitis (JE) has been an important endemic zoonoses in Taiwan. Since beginning in 1968, a mass vaccination program, using mouse-brain-derived and formalin-inactivated JEV Nakayama as vaccine, against JE for children was implemented in Taiwan. Dramatic decrease of JE virus infection has been reported, but still approximately 20-30 cases annually. Approximately 25 percent of infectious patients and 50 percent of the survivals develop permanent neurologic and/or psychiatric sequelae. Recently, the anti-JEV drug was unavailable in clinical therapy. Therefore, it is important to develop a new anti-viral drug.
Lactoferrin exists in breast milk and mucous secretions; it is a iron-binding protein for transportion in intestines. This protein is also associated with non-specific immune response and inhibits a variety of microbial infections including bacterial, fungous, and viral infection. Lactoferrin can inhibit viral cell entrance into cell by binding to the virus particle directly or to membrane-bound heparan sulfate. In previous reports of our laboratory and others, the heparan sulfate on cell surface is one of possible receptors for Japanese encephalitis virus (JEV). The goal of this study was to investigate the inhibitory effect of bovine lactoferrin against JEV infection.
Our results were summarized as below: (1) bovine lactoferrin (bLF) inhibits the infectious JEV, including wild-type (CJN-2K、T1P1、CC27) and laboratory-adapted strains (CJN-L1、CJN-S1、T1P1-L4、T1P1-S1、CC27-L1、CC27-L3、CC27-S6、CC27-S8); (2) bLF inhibits JEV infection by interacting with cells, not viral particle; (3) the mechanism of bLF inhibition JEV infection was not only blocking viral attachment to cellular membrane, but also reducing viral endocytosis and penetration; (4) directly interaction of heparan sulfate (HS) with bLF inhibit JEV infection. In HS-dependent CJN-S1 strain and HE-expressed CHO-K1 cell line, the professional antiviral effect of bLF has been observed; (5) in BHK-21 cells, soluble heparin inhibits the anti-JEV infection activity of bLF; (6) in addition to HS, other unknown molecules may bind to bLF and then inhibit JEV infection, because the antiviral effect of bLF has been observed in HS-independent CJN-L1 strain and HE-deficient CHO-pgsA745 cell line
In this study, we demonstrated that bLF can inhibit JEV infection, however, the protection effect is still needed to study in animal experiments. In the future, it is possible to identify the receptor(s) for JEV using bLF inhibits JEV infection by binding to other unknown molecules. Study of the receptor(s) for JEV is acquired to understand the inhibition mechanism of lactoferrin on JEV infection.

目錄
頁次
致謝…………………………………………………………………………… i
中文摘要……………………………………………………………………… ii
英文摘要……………………………………………………………………… iv
目錄…………………………………………………………………………… vi
圖目錄………………………………………………………………………… X
表目錄………………………………………………………………………… xii
第一章 文獻探討…………………………………………………………… 1
第一節 日本腦炎病毒…………………………………………………… 1
一、流行病學…………………………………………………………… 1
二、病毒學- 分類、組成、型態、特性…………………………………… 2
三、病毒生活史………………………………………………………… 5
1.病毒進入細胞……………………………………………………… 6
1.1貼附/結合/附著(adsorption/ binding/ attachment).……………. 6
1.2胞飲作用(endocytosis) ………………………………………… 7
1.3穿入(penetration)及脫殼(uncoating)...………………………… 8
2.病毒蛋白轉譯…….………………………………………………… 9
3.病毒RNA複製…...………………………………………………… 10
4.組裝(assembly) ……..……………………………………………… 10
5.胞吐作用/出芽(exocytosis/ budding) ……………………………… 10
四、抗日本腦炎病毒藥物開發………………………………………… 11
第二節 乳鐵蛋白………………………………………………………… 12
ㄧ、特性與結構………………………………………………………… 12
二、生物性功能………………………………………………………… 13
三、抗菌、抗黴機制……………………………………………………… 13
四、抗病毒機制………………………………………………………… 14
第二章 研究動機…………………………………………………………… 16
第三章 材料與方法………………………………………………………… 17
第一節 材料……………………………………………………………… 17
一、細胞………………………………………………………………… 17
二、病毒………………………………………………………………… 17
三、藥品及設備………………………………………………………… 18
第二節 實驗方法………………………………………………………… 18
一、病毒培養…………………………………………………………… 18
二、病毒定量…………………………………………………………… 18
三、乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染力試驗………………………… 19
四、日本腦炎病毒經乳鐵蛋白前處理實驗…………………………… 19
五、日本腦炎病毒貼附至BHK-21細胞後之牛乳鐵蛋白藥效試驗… 19
六、日本腦炎病毒貼附試驗(Binding assay) …………………………… 20
七、日本腦炎病毒貼附至CHO-K1和CHO-pgsA745細胞後之乳鐵
蛋白藥效試驗………………………………………………………
20
八、Heparin sepharose實驗…………………………………………….. 21
九、Heparin 競爭試驗………………………………………………….. 21
十、統計分析…………………………………………………………… 21
十一、繪圖軟體………………………………………………………… 22
第四章 結果………………………………………………………………… 23
第一節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染的能力…………………… 23
一、牛乳鐵蛋白對各種日本腦炎病毒株感染細胞能力的影響……… 23
二、牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染之劑量反應關係……………… 24
第二節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染之作用對象……………… 24
一、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒作用後對病毒感染細胞之影響…… 24
二、牛乳鐵蛋白與細胞作用後對日本腦炎病毒感染細胞之影響…… 25
第三節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染之作用步驟……………… 26
一、牛乳鐵蛋白對於日本腦炎病毒貼附到BHK-21細胞上的影響… 26
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 26
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 27
二、牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感染作
用……………………………………………………………………
27
第四節 探討heparan sulfate在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染細
胞中所扮演的角色………………………………………………
28
一、探討heparan sulfate在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒貼附至細
胞上所扮演的角色…………………………………………………
29
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 29
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 30
二、探討牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感
染作用，heparan sulfate所扮演的角色……………………………
32
第五節 探討牛乳鐵蛋白是否直接與heparan sulfate結合後，進而抑制
日本腦炎病毒貼附至細胞………………………………………
33
一、牛乳鐵蛋白與heparin sepharose作用後，殘餘牛乳鐵蛋抑制日
本腦炎病毒感染試驗………………………………………………
33
二、以未貼附病毒量分析牛乳鐵蛋白是否直接與heparan sulfate結
合，進而抑制日本腦炎病毒貼附至細胞…………………………
34
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 34
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 34
第六節 水溶性heparin抑制牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染效力…... 35
第五章 討論………………………………………………………………… 37
第一節 牛乳鐵蛋白對日本腦炎病毒的抑制能力……………………… 37
第二節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用目標……………………… 38
第三節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用步驟……………………… 39
一、病毒貼附步驟……………………………………………………… 39
二、Endocytosis及penetration………………………………………… 39
第四節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用機制：heparan sulfate角色. 40
一、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒競爭細胞膜上的heparan sulfate…… 40
二、Heparin-binding domain特性……………………………………… 40
三、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒套膜蛋白之HS-binding site………… 41
第五節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用機制：其他可能分子…… 42
第六章 結論………………………………………………………………… 43
參考文獻……………………………………………………………………… 68
附錄…………………………………………………………………………… 78

目錄
頁次
致謝…………………………………………………………………………… i
中文摘要……………………………………………………………………… ii
英文摘要……………………………………………………………………… iv
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圖目錄………………………………………………………………………… X
表目錄………………………………………………………………………… xii
第一章 文獻探討…………………………………………………………… 1
第一節 日本腦炎病毒…………………………………………………… 1
一、流行病學…………………………………………………………… 1
二、病毒學- 分類、組成、型態、特性…………………………………… 2
三、病毒生活史………………………………………………………… 5
1.病毒進入細胞……………………………………………………… 6
1.1貼附/結合/附著(adsorption/ binding/ attachment).……………. 6
1.2胞飲作用(endocytosis) ………………………………………… 7
1.3穿入(penetration)及脫殼(uncoating)...………………………… 8
2.病毒蛋白轉譯…….………………………………………………… 9
3.病毒RNA複製…...………………………………………………… 10
4.組裝(assembly) ……..……………………………………………… 10
5.胞吐作用/出芽(exocytosis/ budding) ……………………………… 10
四、抗日本腦炎病毒藥物開發………………………………………… 11
第二節 乳鐵蛋白………………………………………………………… 12
ㄧ、特性與結構………………………………………………………… 12
二、生物性功能………………………………………………………… 13
三、抗菌、抗黴機制……………………………………………………… 13
四、抗病毒機制………………………………………………………… 14
第二章 研究動機…………………………………………………………… 16
第三章 材料與方法………………………………………………………… 17
第一節 材料……………………………………………………………… 17
一、細胞………………………………………………………………… 17
二、病毒………………………………………………………………… 17
三、藥品及設備………………………………………………………… 18
第二節 實驗方法………………………………………………………… 18
一、病毒培養…………………………………………………………… 18
二、病毒定量…………………………………………………………… 18
三、乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染力試驗………………………… 19
四、日本腦炎病毒經乳鐵蛋白前處理實驗…………………………… 19
五、日本腦炎病毒貼附至BHK-21細胞後之牛乳鐵蛋白藥效試驗… 19
六、日本腦炎病毒貼附試驗(Binding assay) …………………………… 20
七、日本腦炎病毒貼附至CHO-K1和CHO-pgsA745細胞後之乳鐵
蛋白藥效試驗………………………………………………………
20
八、Heparin sepharose實驗…………………………………………….. 21
九、Heparin 競爭試驗………………………………………………….. 21
十、統計分析…………………………………………………………… 21
十一、繪圖軟體………………………………………………………… 22
第四章 結果………………………………………………………………… 23
第一節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染的能力…………………… 23
一、牛乳鐵蛋白對各種日本腦炎病毒株感染細胞能力的影響……… 23
二、牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染之劑量反應關係……………… 24
第二節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染之作用對象……………… 24
一、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒作用後對病毒感染細胞之影響…… 24
二、牛乳鐵蛋白與細胞作用後對日本腦炎病毒感染細胞之影響…… 25
第三節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染之作用步驟……………… 26
一、牛乳鐵蛋白對於日本腦炎病毒貼附到BHK-21細胞上的影響… 26
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 26
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 27
二、牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感染作
用……………………………………………………………………
27
第四節 探討heparan sulfate在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染細
胞中所扮演的角色………………………………………………
28
一、探討heparan sulfate在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒貼附至細
胞上所扮演的角色…………………………………………………
29
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 29
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 30
二、探討牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感
染作用，heparan sulfate所扮演的角色……………………………
32
第五節 探討牛乳鐵蛋白是否直接與heparan sulfate結合後，進而抑制
日本腦炎病毒貼附至細胞………………………………………
33
一、牛乳鐵蛋白與heparin sepharose作用後，殘餘牛乳鐵蛋抑制日
本腦炎病毒感染試驗………………………………………………
33
二、以未貼附病毒量分析牛乳鐵蛋白是否直接與heparan sulfate結
合，進而抑制日本腦炎病毒貼附至細胞…………………………
34
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 34
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 34
第六節 水溶性heparin抑制牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染效力…... 35
第五章 討論………………………………………………………………… 37
第一節 牛乳鐵蛋白對日本腦炎病毒的抑制能力……………………… 37
第二節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用目標……………………… 38
第三節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用步驟……………………… 39
一、病毒貼附步驟……………………………………………………… 39
二、Endocytosis及penetration………………………………………… 39
第四節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用機制：heparan sulfate角色. 40
一、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒競爭細胞膜上的heparan sulfate…… 40
二、Heparin-binding domain特性……………………………………… 40
三、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒套膜蛋白之HS-binding site………… 41
第五節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用機制：其他可能分子…… 42
第六章 結論………………………………………………………………… 43
參考文獻……………………………………………………………………… 68
附錄…………………………………………………………………………… 78

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第一章 文獻探討…………………………………………………………… 1
第一節 日本腦炎病毒…………………………………………………… 1
一、流行病學…………………………………………………………… 1
二、病毒學- 分類、組成、型態、特性…………………………………… 2
三、病毒生活史………………………………………………………… 5
1.病毒進入細胞……………………………………………………… 6
1.1貼附/結合/附著(adsorption/ binding/ attachment).……………. 6
1.2胞飲作用(endocytosis) ………………………………………… 7
1.3穿入(penetration)及脫殼(uncoating)...………………………… 8
2.病毒蛋白轉譯…….………………………………………………… 9
3.病毒RNA複製…...………………………………………………… 10
4.組裝(assembly) ……..……………………………………………… 10
5.胞吐作用/出芽(exocytosis/ budding) ……………………………… 10
四、抗日本腦炎病毒藥物開發………………………………………… 11
第二節 乳鐵蛋白………………………………………………………… 12
ㄧ、特性與結構………………………………………………………… 12
二、生物性功能………………………………………………………… 13
三、抗菌、抗黴機制……………………………………………………… 13
四、抗病毒機制………………………………………………………… 14
第二章 研究動機…………………………………………………………… 16
第三章 材料與方法………………………………………………………… 17
第一節 材料……………………………………………………………… 17
一、細胞………………………………………………………………… 17
二、病毒………………………………………………………………… 17
三、藥品及設備………………………………………………………… 18
第二節 實驗方法………………………………………………………… 18
一、病毒培養…………………………………………………………… 18
二、病毒定量…………………………………………………………… 18
三、乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染力試驗………………………… 19
四、日本腦炎病毒經乳鐵蛋白前處理實驗…………………………… 19
五、日本腦炎病毒貼附至BHK-21細胞後之牛乳鐵蛋白藥效試驗… 19
六、日本腦炎病毒貼附試驗(Binding assay) …………………………… 20
七、日本腦炎病毒貼附至CHO-K1和CHO-pgsA745細胞後之乳鐵
蛋白藥效試驗………………………………………………………
20
八、Heparin sepharose實驗…………………………………………….. 21
九、Heparin 競爭試驗………………………………………………….. 21
十、統計分析…………………………………………………………… 21
十一、繪圖軟體………………………………………………………… 22
第四章 結果………………………………………………………………… 23
第一節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染的能力…………………… 23
一、牛乳鐵蛋白對各種日本腦炎病毒株感染細胞能力的影響……… 23
二、牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染之劑量反應關係……………… 24
第二節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染之作用對象……………… 24
一、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒作用後對病毒感染細胞之影響…… 24
二、牛乳鐵蛋白與細胞作用後對日本腦炎病毒感染細胞之影響…… 25
第三節 牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染之作用步驟……………… 26
一、牛乳鐵蛋白對於日本腦炎病毒貼附到BHK-21細胞上的影響… 26
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 26
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 27
二、牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感染作
用……………………………………………………………………
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第四節 探討heparan sulfate在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒感染細
胞中所扮演的角色………………………………………………
28
一、探討heparan sulfate在牛乳鐵蛋白抑制日本腦炎病毒貼附至細
胞上所扮演的角色…………………………………………………
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(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 29
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 30
二、探討牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感
染作用，heparan sulfate所扮演的角色……………………………
32
第五節 探討牛乳鐵蛋白是否直接與heparan sulfate結合後，進而抑制
日本腦炎病毒貼附至細胞………………………………………
33
一、牛乳鐵蛋白與heparin sepharose作用後，殘餘牛乳鐵蛋抑制日
本腦炎病毒感染試驗………………………………………………
33
二、以未貼附病毒量分析牛乳鐵蛋白是否直接與heparan sulfate結
合，進而抑制日本腦炎病毒貼附至細胞…………………………
34
(一) 未貼附病毒量分析……………………………………………… 34
(二) 貼附病毒量分析………………………………………………… 34
第六節 水溶性heparin抑制牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染效力…... 35
第五章 討論………………………………………………………………… 37
第一節 牛乳鐵蛋白對日本腦炎病毒的抑制能力……………………… 37
第二節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用目標……………………… 38
第三節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用步驟……………………… 39
一、病毒貼附步驟……………………………………………………… 39
二、Endocytosis及penetration………………………………………… 39
第四節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用機制：heparan sulfate角色. 40
一、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒競爭細胞膜上的heparan sulfate…… 40
二、Heparin-binding domain特性……………………………………… 40
三、牛乳鐵蛋白與日本腦炎病毒套膜蛋白之HS-binding site………… 41
第五節 牛乳鐵蛋白之抗日本腦炎病毒作用機制：其他可能分子…… 42
第六章 結論………………………………………………………………… 43
參考文獻……………………………………………………………………… 68
附錄…………………………………………………………………………… 78
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表一、 各日本腦炎病毒株於套膜蛋白上胺基酸的差異………………... 61
表二、 牛乳鐵蛋白抗日本腦炎病毒感染之劑量反應關係……………... 62
表三、 以細胞膜貼附病毒量分析牛乳鐵蛋白對於日本腦炎病毒貼附到BHK-21細胞上的影響…………………………………………
63
表四、 牛乳鐵蛋白在日本腦炎病毒貼附到細胞膜之後的抗病毒感染作用………………………………………………………………...
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表五、 以細胞膜貼附病毒量分析牛乳鐵蛋白對於日本腦炎病毒貼附到CHO-K1細胞上的影響………………………………………...
65
表六、 以細胞膜貼附病毒量分析牛乳鐵蛋白對於日本腦炎病毒貼附到CHO-pgsA745細胞上的影響…………………………………..
66
表七、 乳鐵蛋白具廣效性的抗病毒能力………………………………... 67

參考文獻

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