臺灣博碩士論文加值系統

有鑑於蛋白質體學技術的發展，越來越多的生物醫學界投入大筆資金與人力，進行蛋白質體學的研究與探討臨床醫學上的應用，並以高解析度的質譜儀大規模分析樣品中許多蛋白質的身份。基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF/MS) 具有準確、分析時間短、高靈敏度與測量大分子等優點，在蛋白質體學分析上是不可或缺的工具。
最近有文獻指出，以微波輔助消化反應可在短時間內完成蛋白質定性分析。但我們發現以微波輔助消化反應後所得到質譜圖的胜肽片段，與傳統消化方式比較，會多出一些錯失切位胜肽片段，換句話說，蛋白質的某些特定切位於微波輔助消化反應中，酵素並未與之發生水解作用，導致反應不完全。為了解決此一現象，本實驗利用不同的溶劑、酵素對蛋白質的莫耳數比與微波溫度分別探討，發現使用 50 mM Tris buffer、酵素對蛋白質的莫耳數比 1：5 與微波溫度 60℃，為最佳化條件，其反應結果最接近傳統消化。利用此最佳化條件，在微波輔助消化反應上，可以應用在定量分析，因為當我們要對蛋白質某一序列片段做定量，此片段需未含錯失切位，定量的結果才具有準確性與可靠性。因此微波輔助蛋白質消化反應不僅可應用在蛋白質的定性分析，若能成功應用於定量分析，相信微波輔助消化的快速分析系統必能取代冗長的傳統方法。

The development of proteomics technology has allured increasingly greater investments of financial and human capitals to improve its applicability and performance in clinical research. Among all research programs, high-resolution mass spectrometry is being used to probe, in a large scale, the molecular identity of many proteins. In addition, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry has proved its unique and indispensable role in the analysis of large biomolecules such as proteins for its accuracy, shorter analysis time and high-sensitivity.
Recent literature has shown that the microwave-assisted digestion reaction can be applied to the qualitative analysis of proteins within a short period of time. However, compared to conventional digestion, microwave-assisted digestion reactions often yields some miss-cleavaged peptides, resulting from incomplete hydrolysis reactions between enzymes and substrates. In this research, we investigated the effects of different solvents, different protein / enzyme molar ratios and varying microwave temperatures in the digestion completeness. We have concluded that a protein / enzyme molar ratio of 1：5 in a 50 mM Tris buffer at a microwave temperature of 60℃ is the optimized experimental condition.

摘要
Abstract
表目錄
圖目錄
壹、緒論
1、前言
2、質譜儀簡介
3、基質輔助雷射脫附游離－飛行時間質譜法
3.1、發展與原理
3.2、基質的特性與功能
3.3、飛行時間質量分析器
4、微波輔助蛋白質消化作用
4.1、微波加熱原理與裝置
4.2、微波在蛋白質體學上的應用
5、蛋白質電泳
貳、實驗
1、藥品與儀器
1.1、藥品
1.2、儀器
1.2.1、質譜儀條件
1.2.2、聚焦式微波儀器條件
1.2.3、家用微波爐條件
1.2.3.1、家用微波爐反應溫度偵測
2、基質溶液製備
3、溶劑的選擇
4、實驗步驟
4.1、傳統消化反應
4.2、Myoglobin 微波消化反應
4.3、Cytochrome C 微波消化反應
4.4、Lysozyme 微波消化反應
4.5、應用最佳化條件於其他蛋白質
4.5.1、Ubiquitin 微波消化反應
4.5.2、Ribonuclease A 微波消化反應
4.5.3、α-Casein 微波消化反應
4.5.4、Albumin 微波消化反應
4.5.5、Transferrin 微波消化反應
4.6、應用最佳化條件於一維蛋白質膠體電泳法
4.6.1、製備方式與分離蛋白質
4.6.2、In-gel digestion
參、結果與討論
1、Myoglobin 傳統消化與使用不同溶劑微波消化反應之比較
2、Cytochrome C 傳統消化與使用不同溶劑微波消化反應之比較
3、Lysozyme 傳統消化與使用不同溶劑微波消化反應之比較
4、應用最佳化條件於其他蛋白質
4.1、Ubiquitin 傳統與微波消化反應之比較
4.2、Ribonuclease A 傳統與微波消化反應之比較
4.3、α-Casein 傳統與微波消化反應之比較
4.4、Albumin 傳統與微波消化反應之比較
4.5、Transferrin 傳統與微波消化反應之比較
5、應用最佳化條件於一維蛋白質膠體電泳法
5.1、Lysozyme 傳統與微波消化反應之比較
5.2、Myoglobin 傳統與微波消化反應之比較
5.3、α-Casein 傳統與微波消化反應之比較
5.4、Albumin 傳統與微波消化反應之比較
5.5、Transferrin 傳統與微波消化反應之比較
肆、結論
伍、參考文獻
附錄

1. Yamashita, M.; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4451-4459.
2. Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, 2299-2301.
3. Pappin, D. J. C.; Hojrup, P.; Bleasby, A. J. Current. Biology. 1993, 3, 327-332.
4. Thomson, J. J. Rays of Positive Electricity and Their Application to Chemical Analysis; Pergamnon Press: Longmans, Green and Co. Ltd, London, 1913.
5. Skoog, D. A.; Hollerand, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis, Fifth Edition, SaundersCollege Publishing, Philadelphia, 1998.
6. Nier, A. O. Rev Sci Instrum. 1947, 18, 398-411.
7. Munson, M. S. B.; Field, F. H. J. Am. Chem. Soc. 1960, 88, 2621-2630.
8. Beckey, H. D. Principles of Fiela Ionization and Field Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977.
9. Barber, M.; Bordoli, R. S.; Ellott, G. J.; Sedgwick, R. D.; Tyler, A. N. Anal. Chem. 1982, 54, 645A-657A.
10. Unsold, E.; Hillenkamp, F.; Nitsche, R. Analysis 1990, 4, 115.
11. Cotter, R. J. Anal. Chem. 1988, 60, 781A-793A.
12. Benninghoven, A.; Rudenauer, F. G.; Werner, H. W. Secondary Ion Mass Spectrometry: Basic Concepts, Instrumental Aspects, Applications and Trends, Wiley, Chichester, 1987.
13. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151-153.
14. Kussmann, M.; Nordhoff, E.; Rahbek-Nielsen, H.; Haebel, S.; Rossel-Larsen, M.; Jakobsen, L.; Gobom, P.; Roepstorff, J. J. Mass Spectrom. 1997, 32, 593-601.
15. Spengler, B.; Kirsch, D.; Kaufmann, R.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992, 6, 105-108.
16. Weickhardt, C.; Schmid, R. P. Int. J. Mass Spectrom. 2001, 206, 181-190.
17. Hakansson, P.; Piyadasa, C. K. G.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13, 620-624.
18. Spengler, B. J. Mass Spectrom. 1997, 32, 1019-1036.
19. Chaurand, P.; Luetzenkirchen, F.; Spengler, B. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999, 10, 91-103.
20. Schierhorn, A. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13, 362-369.
21. Giguere, R. J.; Bray, T. L.; Duncan, S. M.; Majetich, G. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 4945-4949.
22. Bose, A. K.; Manhas, M. S.; Ghosh, M. Heterocycles 1990, 30, 741-744.
23. Beldjoudi, N.; Bouazizi, A.;. Douibi, D; Gourdenne, A. Eur. Polym. J. 1988, 24, 49-52.
24. Yoshio, I.; Hisashi, N.; Masa-Aki, K. J. Polymer Sci. Part A : Polym. Chem. 1996, 34, 701-704.
25. Kim, J. K.; Kwon, P. S.; Kwon, T. W. Synth. Commun. 1990, 26, 535.
26. Loupy, A.; Petit, A.; Ramdani, M. Can. J. Chem. 1993, 71, 90-95.
27. Baghurst, D. R.; Cooper, S. R.; Greene, D. L.; Mingos, P.; Reynolds, S. M. Polyhedron 1990, 9, 893-895.
28. Hwang, D. R.; Moerlein, S. M.; Lang, L.; Welch, M. J. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 23, 1799-1801.
29. Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Wang, K. T. J. Chin. Chem. Soc. 1991, 38, 85-91.
30. Bose, A. K.; Ing, Y. H.; Lavlinskaia, N.; Sareen, C.; Pramanik, B. N.; Bartner, P. L.; Liu, Y. H.; Heimark, L. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2002, 13, 839-850.
31. Zhong, H.; Zhang, Y.; Li, L. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1291-1296.
32. Lin, S. S.; Wu, C. H.; Sun, M. C.; Sun, C. M.; Ho, Y. P. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005, 16, 581-588.
33. Juan, H. F.; Chang, S. C.; Huang, H. C.; Chen, S. T. Proteomics 2005, 5, 840-842.
34. Chen, W. Y.; Chen, Y. C. Anal Chem. 2007, 79, 2394-2401.
35. Lin. H.; Teck, Y. L.; Siu, K. S. Proteomics 2006, 6, 586–591.
36. Thiede, B.; Lamer, S.; Mattow, J.; Siejak, F.; Dimmler, C.; Rudel, T.; Jungblut, P. R. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, 496-502.
37. Tiselius, A. Trans. Faraday Soc. 1937, 33, 524-531.
38. Raymond, S.; Weintraub, L. S. Science 1959, 130, 711.
39. Shapiro, A. L.; Viñuela, E.; Maizel, J. V. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967, 28, 815-820.
40. Fales, H. M.; Boja, E. S. Anal. Chem. 2001, 73, 3576-3582.
41. Kroll, J.; Rawel, H.; Krock, R. Z. Lebensm. Unters Forsch A. 1998, 207, 202-206.
42. Pramanik, B. N.; Mirza, U. A.; Ing, Y. H.; Liu, Y. H.; Bartner, P. L.; Weber, P. C.; Bose, A. K. Protein Science 2002, 11, 2676-2687.
43. Zaks, A.; Klibanov, A. M. J. Biol. Chem. 1988, 263, 8017-8021.
44. Zaks, A.; Klibanov, A. M. J. Biol. Chem. 1988, 263, 3194-3201.
45. Lopez-Ferrer, D.; Canas, B.; Lodeiro, C.; Rial-Otero, R.; Moura, I.; Capelo, J. L. Trends Analyt. Chem. 2006, 25, 996-1005.
46. Laugesen, S.; Roepstorff, P. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003, 14, 992-1002.
47. Padliya, N. D.; Wood, T. D. Proteomics 2004, 4, 466-473.
48. Pohlentz, G.; Kolbl, S.; Peter-Katalinic, J. Proteomics 2005, 5, 1758-1763.
49. Choudhary, G.; Wu, S.; Shieh, P.; Hancock, W. S. J. Proteome Res. 2003, 2, 59-67.
50. Freije, J. R.; Mulder, P.; Werkman, W.; Rieux, L.; Niederlander, H.; Verpoorte, E.; Bischoff, R. J. Proteome Res. 2005, 4, 1805-1813.
51. Lopez-Ferrer, D.; Capelo, J. L.; Vazquez, J. J. Proteome Res. 2005, 4, 1569-1574.
52. Kim, S. C.; Chen, Y.; Mirza, S.; Xu, Y.; Lee, J.; Liu, P.; Zhao, Y. J. Proteome Res. 2006, 5, 3446-3452.
53. Russell, W. K.; Park, Z.; Russel. D. H. Anal. Chem. 2001, 73, 2682-2685.
54. Izquierdo, F. J.; Alli, I.; Yaylayan, V.; Gomez, R. Int. Dairy J. 2007, 17, 465-470.
55. Fan, X.; You, J.; Tan, G.; Yu, X.; Jiao, T. Prog. Chem. 1998, 3, 285.
56. http://www.matrixscience.com/
57. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/