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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:翁嘉珍
研究生(外文):Chia-Chen Weng
論文名稱:日本腦炎病毒基因體複製分析及發現其反轉錄不需引子
論文名稱(外文):Viral replication analysis of Japanese encephalitis virus and discovery of RT-primer-independent amplification of viral cDNA
指導教授:張瑞宜張瑞宜引用關係
指導教授(外文):Ruey-Yi Chang
學位類別:碩士
校院名稱:國立東華大學
系所名稱:生物技術研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2007
畢業學年度:95
語文別:中文
論文頁數:60
中文關鍵詞:反轉錄北方點墨法複製日本腦炎病毒3'-未轉譯區段小片段RNA較大基因體
外文關鍵詞:self-priminglarger-sized RNAJapanese encephalitis virusreplicationNorthern analysisreverse transcription3'-untranslated regionsmall RNA
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日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus,簡稱JEV)基因體為一條正股、全長 10976 nts的RNA,本實驗室之前研究利用Northern analysis偵測JEV感染後的細胞內RNA,發現除了全長的正股 RNA之外,還有一個大小約為521-523 nts,且序列與病毒基因體3'-未轉譯區段之高度保留序列相同之RNA分子,稱之為small RNA (Journal of Virology 78:5133,2004)。為研究small RNA在病毒複製過程所扮演之角色,本研究以轉染sense-及antisense-small RNA於已感染病毒之BHK-21細胞,發現轉染antisense-small RNA會抑制病毒正股RNA合成量,顯示small RNA可能具有調節病毒正股RNA合成之功能。另一方面,在本研究中偵測到正、負股基因體有一個遠大於病毒基因體之RNA分子,稱為Larger 2 RNA (簡稱L2 RNA),以RT-PCR分析結果推測其不是病毒基因多倍體,可能為Northern hybridization電泳中未完全denature之病毒複製中間型。另藉RT-PCR方式分析此較大基因體結構過程中發現, JEV正股基因體不需引子即可進行反轉錄作用,由於病毒基因體之3'-端有一個高度保留二級結構3'-long stable hairpin (簡稱3'-LSH),推測在反轉錄作用中可當作引子,故推測病毒基因體在反轉錄作用中具有self-priming之功能。
Japanese encephalitis virus (JEV) possesses a single positive- stranded RNA genome of 10,976 nucleotides in length. Previous studies in our laboratory have reported the abundant accumulation of a 3'-terminal 521- to 523-nucleotides genome fragment named small RNA, representing the highly conserved region of the 3'-untranslated region, in JEV-infected cells. To address possible functions of the small RNA during viral replication, unit-length (i.e. 523-nt) sense- and antisense-small RNA were separately transfected into JEV-infected cells and the effects on plus- and minus-strand accumulation were measured by strand-specific Northern hybridization. Transfecting of small RNA appeared not to affect plus- or minus-strand viral RNA accumulation, while transfecting of anti-sense small RNA caused an inhibition of plus-strand RNA but not minus-strand RNA accumulation. The high molecular weight viral RNAs (relative 2X genome size) observed earlier and in this study were demonstrated not a dimer or a multimer of viral genome by serial RT-PCR analyses. Through these analyses, an interesting phenomenon that JEV specific cDNA could be amplified by RT-PCR without primer added during RT step was found. These results suggested that JEV genome, presumably the 3'-long stable hairpin, might serve as a primer during RT step and JEV specific cDNA subsequently were amplified through PCR.
第一章 前言 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
1. 日本腦炎 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
2. 日本腦炎基因體 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
3. 3'-端未轉譯區段 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
3.1. 3'-long stable haipin •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
3.2. 3'-conserved sequence ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
3.2.1. Conserved sequence 1 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
3.2.2. Tandem repeat sequences •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••4
4. 黃質病毒RNA之複製 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5
4.1. 複製過程 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5
4.2. 病毒正、負股RNA在被感染的細胞中含量不同 ••••••••••••••••••••••••6
5. small RNA之發現 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
6. 兩倍負股基因體之發現 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••7
7. 轉染antisense-small RNA促使1X負股基因體產生 ••••••••••••••••••••••7
8. 研究目的 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8
第二章 材料與方法 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
1. 本研究所使用之引子(參照Table. 1)
2. 本實驗所使用及構築之質體(參照Table. 2)
3. 構築質體 pUC 18/ JEV 10976-10454 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
4. 細胞與病毒 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
4.1. 細胞培養與繼代 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
4.2. 日本腦炎病毒之製備 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
4.3. 病毒力價測試 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13
4.4. 取樣病毒感染後不同時間點的總量RNA之培養方法 ••••••••••••13
4.5. 轉染RNA至已感染JEV RP-9的細胞中 ••••••••••••••••••••••••••••••••••14
5. 細胞總量RNA之純化 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
6. 北方點墨法 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
7. 以RT-PCR分析L2 RNA ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
8. 以RT-PCR分析病毒self-priming ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
第三章 結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
1. Northern analysis 使用之探針專一性測試 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
2. JEV病毒感染BHK-21細胞後正、負股基因體之表現 ••••••••••••••••27
3. JEV病毒感染蚊子細胞C6/36後正、負股基因體的偵測 ••••••••••••29
4. 轉染sense-或antisense-small RNA對於病毒正、負股複製之影響••30
5. 以RT-PCR方式分析L2 RNA(+)及L2 RNA(-) •••••••••••••••••••••••••••••••32
6. JEV RNA在RT反應中可能具有self-priming能力 ••••••••••••••••••••••33
6.1. 病毒感染之細胞總量RNA可在沒有引子的狀況下
進行反轉錄 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34
6.2. 利用DI RNA transcripts證明病毒分子本身結構
可提供反轉錄時之引子 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
第四章 討論 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••37
1. 較大基因體之探討 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••38
2. 轉染antisense-small RNA促使一略大於基因體之RNA產生 ••••••••40
3. small RNA可能調控正股基因體之合成 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••41
4. JEV基因體RNA在RT反應中可self-priming •••••••••••••••••••••••••••••••••43
第五章 參考文獻 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••44
圖表 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••47
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