臺灣博碩士論文加值系統

摘要

幾丁質(chitin)為無脊椎動物與真菌細胞壁的主要構成成份，而乙醯化程度(DA)的不同會影響幾丁質和幾丁聚醣的特性，因此乙醯化程度(DA)的測定是重要的。
利用本實驗之改良式高效能液相層析法(HPLC)(A)及(B)，可以測定5~80％乙醯化程度的幾丁質和幾丁聚醣樣品，藉由改良酸水解的條件，將硫酸的添加量由0.5 mL增加到1.5 mL，酸水解的溫度由155℃降低到110℃，酸水解的的時間由1小時減少到30-40分鐘，可以改善樣品炭化的情況，也可以減少樣品前處理及實驗的時間。
此改良式高效能液相層析法(A)及(B)的準確性也比其他測定方法，如紅外光光譜法(IR)、紫外光光譜法(UV)等為佳。因此在利用紅外光光譜法(IR)測定樣品的乙醯化程度上，可以利用本實驗之改良式高效能液相層析法(A)代替核磁共振光譜法(NMR)建立校正曲線，以當做紅外光光譜法(IR)的參考。

Abstract

Chitin is the mainly constitution of invertebrates and the cell wall of fungus. The different degree of N-acetylation(DA) can influence the properties of chitin and chitosan, so to determine DA is important.
Using the improved HPLC A and B can determine chitin and chitosan with DA range from 25 to 85％. Improved conditions of acid hydrolysis which increase the content of sulfuric acid from 0.5 mL to 1.5 mL, decrease the temperature from 155℃ to 110℃ and time of acid hydrolysis from 1 hrs to 30-40 mins, it can reduce sugar caramelization and the time of samples preparation.
The improved HPLC A and B is more accurate and more precise than other ways, such as IR spectroscopy、UV spectroscopy etc ; therefore using IR spectroscopy determine the DA of samples, we can use the improved HPLC A to take place of NMR spectroscopy to build the calibration curves which become a standard of IR spectroscopy.

目錄
頁次
中文摘要………………………………………………………………….Ⅰ
英文摘要………………………………………………………………….Ⅱ
目錄……………………………………………………………………….Ⅲ
表目錄…………………………………………………………………….Ⅶ
圖目錄…………………………………………………………………….Ⅷ
壹、 前言………………………………………………………………….1
貳、 文獻整理…………………………………………………………….2
一、 幾丁質的來源…………………………………………………….2
二、 幾丁質與幾丁聚醣之結構……………………………………….2
三、 幾丁質與幾丁聚醣之應用……………………………………….3
四、 幾丁質與幾丁聚醣酸水解的機制……………………………….4
五、 幾丁質與幾丁聚醣N-乙醯化程度之測定方法…………………5
(一) 核磁共振光譜法………………………………………………..6
1. 1H-NMR法………………………………………………………6
2. 15N-NMR法……………………………………………………...7
3. 13C-NMR法……………………………………………………...7
(二) 紅外線光譜法………………………………………………….8
(三) 一次微分紫外光光譜法………………………………………10
(四) 高效能液相層析法……………………………………………12
參、 材料與方法………………………………………………………...15
一、 材料……………………………………………………………...15
(一) 樣品..…………………………………………………………..15
(二) 標準品..………………………………………………………..15
(三) 藥品..…………………………………………………………..16
(四) 層析管柱..……………………………………………………..16
(五) 儀器..…………………………………………………………..17
二、 方法………………………………………………………………18
(一) 製備不同乙醯化程度的幾丁質..……………………………...18
(二) 灰份含量測定………………………………………………….18
(三) 蛋白質含量測定……………………………………………….19
(四) 水分含量測定………………………………………………….19
(五) N-乙醯化程度之測定………………………………………….20
1. 13C核磁共振(13C NMR)光譜法…………………………….....20
(1) 13C核磁共振光譜測定………………………………………20
(2) N-乙醯化程度測定程度之計算……………………………..20
2. 高效能液相層析法……………………………………………20
2.1 邱氏法……………………………………………………..20
(1) 標準品的製備及分析…………………………………….20
(2) 樣品的製備及分析……………………………………….21
2.2 Ng高效能液相層析法……………………………………..23
(1) 標準品的製備及分析…………………………………….23
(2) 樣品的製備及分析……………………………………….23
2.3改良式高效能液相層析法(A)……………………………..24
2.4改良式高效能液相層析法(B)……………………………..24
3. 紅外光光譜法…………………………………………………25
(1) 紅外光光譜測定…………………………………………….25
(2) N-乙醯化程度測定程度之計算…………………………….25
(六) 統計分析……………………………………………………….26
肆、 結果與討論………………………………………………………….27
(一) 水份、灰份及蛋白質之含量…………………………………….27
(二) N-乙醯化程度之測定…………………………………………….27
1. 13C核磁共振(13C NMR)光譜法…………………………………27
2. 高效能液相層析法………………………………………………28
2.1 邱氏法………………………………………………………....28
2.2 Ng高效能液相層析法………………………………………...29
2.3 改良式高效能液相層析法(A)………………………………..29
2.4 改良式高效能液相層析法(B)………………………………...30
2.5 不同高效能液相層析法之比較……………………………....30
3. 紅外光光譜(IR)法……………………………………………….32
伍、 結論………………………………………………………………….35
陸、 參考文獻…………………………………………………………….36
表………………………………………………………………………….41
圖………………………………………………………………………….44










表目錄

表一、樣品之水份、蛋白質及灰份含量(％)…………………………..41
表二、不同HPLC與13C-NMR所測得幾丁質樣品乙醯化程度值之變異數析……………………………………………………………………….42
表三、不同方法所測得幾丁質樣品乙醯化程度值之變異數分析…….43

























圖目錄

圖一、幾丁質之紅外光光譜圖………………………………………..44
圖二、樣品A之13C核磁共振光譜圖………………………………..45
圖三、樣品B之13C核磁共振光譜圖………………………………..46
圖四、樣品C之13C核磁共振光譜圖………………………………..47
圖五、樣品D之13C核磁共振光譜圖………………………………..48
圖六、樣品E之13C核磁共振光譜圖………………………………...49
圖七、樣品F之13C核磁共振光譜圖………………………………...50
圖八、樣品G之13C核磁共振光譜圖………………………………..51
圖九、樣品A於邱氏法之層析圖……………………………………..52
圖十、樣品B於邱氏法之層析圖……………………………………...53
圖十一、樣品C於邱氏法之層析圖…………………………………...54
圖十二、樣品D於邱氏法之層析圖…………………………………..55
圖十三、樣品E於邱氏法之層析圖…………………………………...56
圖十四、樣品F於邱氏法之層析圖…………………………………...57
圖十五、樣品G於邱氏法之層析圖…………………………………..58
圖十六、樣品A於Ng法之層析圖…………………………………...59
圖十七、樣品B於Ng法之層析圖…………………………………...60
圖十八、樣品C於Ng法之層析圖…………………………………...61
圖十九、樣品D於Ng法之層析圖…………………………………...62
圖二十、樣品E於Ng法之層析圖…………………………………...63
圖二十一、樣品F於Ng法之層析圖…………………………………64
圖二十二、樣品G於Ng法之層析圖………………………………...65
圖二十三、樣品A於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………66
圖二十四、樣品B於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………67
圖二十五、樣品C於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………68
圖二十六、樣品D於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………69
圖二十七、樣品E於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………70
圖二十八、樣品F於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………71
圖二十九、樣品G於改良式高效能液相層析法(A)之層析圖………72
圖三十、樣品A於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖…………73
圖三十一、樣品B於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖………74
圖三十二、樣品C於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖………75
圖三十三、樣品D於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖………76
圖三十四、樣品E於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖……….77
圖三十五、樣品F於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖……….78
圖三十六、樣品G於改良式高效能液相層析法(B)之層析圖………..79
圖三十七、樣品A之紅外光光譜圖…………………………………....80
圖三十八、樣品B之紅外光光譜圖…………………………………....81
圖三十九、樣品C之紅外光光譜圖…………………………………....82
圖四十、樣品D之紅外光光譜圖……………………………………....83
圖四十一、樣品E之紅外光光譜圖…………………………………....84
圖四十二、樣品F之紅外光光譜圖…………………………………....85
圖四十三、樣品G之紅外光光譜圖……………………………………86
圖四十四、紅外光光譜之A1320/A1420之吸光值比與由改良式高效能液相層析法(A)所得之N-乙醯化程度之關係………………………………..87
圖四十五、紅外光光譜之A1320/A1420之吸光值比與由13C核磁共振光譜法所得之N-乙醯化程度之關係…………………………………………88
圖四十六、紅外光光譜之A1660/A2880之吸光值比與由改良式高效能液相層析法(A)所得之N-乙醯化程度之關係………………………………...89
圖四十七、紅外光光譜之A1660/A2880之吸光值比與由13C核磁共振光譜法所得之N-乙醯化程度之關係…………………………………………90

陸、參考文獻

邱明乾，2005，以改良式高效能液相層析法與紅外光光譜法測定幾丁質/幾丁聚醣N-乙醯化程度，國立台灣海洋大學食品科學研究所碩士論文，基隆。
陳君涵，2004，以染劑吸附法及一次微分紫外光光譜法測定幾丁質類的產品之純度及乙醯化程度，國立台灣海洋大學食品科學研究所碩士論文，基隆。
陳榮輝，2001，幾丁質、幾丁聚醣的生產製造、檢測與應用，科學發展月刊，29:776-787。
陳澄河，2003，蝦蟹殼傳奇，科學發展月刊，369：63-67。
游士弘，1997，幾丁質與幾丁聚醣之N-乙醯化程度及純度探測定方
法之探討，國立台灣海洋大學食品科學研究所碩士論文，基隆。
蔡敏郎，1993，不同分子量、不同去乙醯程度的幾丁聚醣溶液的流變性質與膠囊物性之關係，國立台灣海洋大學食品科學研究所碩士論文，基隆。
劉曉君，2001，幾丁質產品純度分析方法之建立，國立台灣海洋大學食品科學研究所碩士論文，基隆。

A. O. A. C. ( Association of Offical Analytical Chemists ), 1997. In : W. Horwitz ( Editor ), Offical Methods of Analysis, 16th ed. Washington, D.C.
Baumann, H. and Faust, V. 2001. Concepts for improved regioselective placement of O-sulfo, N-sulfo, N-acetyl, and N-carboxymethyl groups in chitosan derivatives. Carbohydrate Research . 331 : 43–57.
Brugnerotto, J., Lizardi, J., Goycoolea, F., ArguÈelles-Monal, M. W., DesbrieÁres, J. and Rinaudo, M. 2001. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization. Polymer . 42 : 3569-3580.
Cho, Y. W., Jang, J., Park, C. R. and Ko, S. W. 2000. Preparation and Solubility in Acid and Water of Partially Deacetylated Chitins. Biomacromolecules. 1 : 609-614.
Duarte, M. L., Ferreira , M. C., Marvão, M. R. and Rocha, J. 2001. Determination of the degree of acetylation of chitin materials by 13C CP/ MAS NMR spectroscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 28 : 359–363.
Duarte, M. L., Ferreira, M. C., Marvão, M. R. and Rocha, J. 2002. An optimised method to determine the degree of acetylation of chitin and chitosan by FTIR spectroscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 31 : 1-8.
Fernandez-Megia, E., Novoa-Carballal, R., Quinoa, E., and Riguera, R. 2005. Optimal routine conditions for the determination of the degree of acetylation of chitosan by 1H-NMR. Carbohydrate Polymer. 61 : 155-161.
Kumar, M. N. V. R. 2000. A review of chitin and chitosan applications. Reactive & Functional Polymers. 46 : 1–27.
Kurita, K. 2001.Controlled functionalization of the polysaccharide chitin. Progress in Polymer Science. 26 : 1921-1971.
Khor, E. and Lim, L. Y. 2003. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 : 2339-2349.
Lavertu, M., Xia, Z., Serrqei, A. N., Berrada, M., Rodrigues, A., Wang, D., Buschmann, M. D ., and Gupta, A. 2003. A validated 1H NMR method for the determination of the degree of deacatylation of chitosan. Journal of Pharmaceutical Biochemical Analysis. 32 : 1149-1158.
Muzzarelli, R. A. A. and Rocchetti, R. 1985. Determination of the degree of acetlation of chitosans by first derivative ultraviolet spectrophotometry. Carbohydrate Polymers. 5 : 461-472.
Ng, C., Hein, S ., Chandrkrachang, S., Stenens, W. F. 2005. Evalution of an Improved Acid Hydrolysis-HPLC Assay for the Acetyl Content in Chitin and Chitosan. Applied Biomaterials. 25 : 2075-2079
Niola, F., Basora, N., Chornet, E. and Vidal, F. 1993. A rapid method for the determination of the degree of N-acetylation of chitin-chitosan samples by acid hydrolysis and HPLC. Carbohydrate Research. 238 : 1-9.
Novikov, V. Yu. 2004. Acid Hydrolysis of Chitin and Chitosan. Russian Journal of Applied Chemistry. 77(3) : 484-487.
Raymond, L., Morin, F. G. and Marchessault, R. H. 1993. Degree of deacetylation of chitosan using conductometric titration and solid-state NMR. Carbohydrate Research. 246 : 331-336.
Reginster, J., Y., Deroisy, R., Rovati, L., C., Lee, R., L., Lejeune, E., Bru yere, O., Giacavelli, G., Henrotin., Y., Dacre, J., E., and Gossett, C. 2001. Long-term effects of glucosamine sulphate on osteoarthritis progression: a randomized, placebo-controlled clinical trial.The Lancet. 357 : 251-56.
Sandford, P. A. 2002. Commercial sources of chitin&chitosan and their utilization. In: Advances in Chitin Science (Ⅵ). ed. by Vårum, K. M., Domard, A. and Smidsrød, O. p: 35-42.
Sannan, T., Kurita, K., Ogura, K. and Iwakura,Y. 1978. Studies on chitin: 7. I.r. spectroscopic determination of degree of deacetylation. Polymer. 19 : 458- 459.
Shahidi, F., Arachchi, J. K. V. and Jeon, Y. J. 1999. Food applications of chitin and chitosans.Trends in Food Science & Technology, 10 : 37-51.
Shigemasa, Y., Matsuura, H., Sashiwa, H. and Saimoto, H. 1996. Evaluation of different absorbance ratios from infrared spectroscopy for analyzing the degree of deacetylation in chitin. International Journal of Biological Macromolecules. 18 : 237-242.
Shimahara, K., Ohkochi, K. and Ikeda, M. 1982. A new isolation Method of crustacean chitin using a proteolytic bacterium Pseudomonas maltophilia. In: Chitin and Chitosan, Proceedings of the Second international Conference on Chitin and Chitosan. ed. by Hirano, S. and Tokuro, S. The Japanese Society of Chitin and Chitosan. p : 10-14.
Tan, S. C., Khor, E., Tan, T. K., and Wong, S. M. 1998. The degree of deacetylation of chitosan:advocating the first derivative UV-spectrophotometry method of determination. Talata. 45 : 713-719.
Van de Velde, K.and Kiekens, P.2004. Structure analysis and degree of substitution of chitin, chitosan and dibutyrylchitin by FT-IR spectroscopy and solid state 13C NMR.Carbohydrate Polymers. 58 : 409 – 416.
Vårum, K. M., Anthonsen, M. W., Grasdalen, H, and Smidsrød, O. 1991. Determination of the degree of N-acetylation and the distribution of N-acetylted chitins ( chitosans ) by high-field n.m.r. spectroscopy. Carbohydrate Research. 211 : 17-23.
Vårum, K. M., Ottøy, M. H., and Smidsrød, O. 2001 Acid hydrolysis of chitosans. Carbohydrate Polymers. 46(1) : 89-98.
Yu, G., Morin, F. G., Nobes, G. A. R., and Marchessault, R. H. 1999.
Degree of acetylation of chitin and extent of grafting PHB on chitosan determined by solid state 15N-NMR. Macromolecules. 32 : 518-520.