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研究生:賴俊吉
研究生(外文):Jyun-Ji Lai
論文名稱:反平行式核酸三螺旋結構的物性研究
論文名稱(外文):A Physical Study of Anti-Parallel Type Triple Helices
指導教授:靳宗玫
指導教授(外文):Tsung-Mei Chin
學位類別:碩士
校院名稱:中國文化大學
系所名稱:應用化學研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2007
畢業學年度:95
語文別:中文
論文頁數:89
中文關鍵詞:反平行式核酸三螺旋嘌呤‧嘌呤‧嘧啶鹼基三聚體精胺
外文關鍵詞:Anti-Parallel Type Triple HelicesPuPuPy motifspermine
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本實驗室是第一次以反平行式核酸三螺旋作為研究項目,設計探針股與目標股以嘌呤‧嘌呤‧嘧啶鹼基三聚體方式生成反平行式核酸三螺旋。本論文設計了兩組寡核酸序列組合5’-d-(AG)4T4(CT)4 + 5’-d-(GA)4與5’-d-(AG)4T4(GA)4 + 5’-d-(CT)4,此二組序列所設計之核酸三螺旋結構,其鹼基三聚體組成相同而架橋連結位置不同。實驗結果顯示,此兩種組合有不同的熔點溫度,因此推論架橋連結位置的不同會影響核酸鏈聚合程度與結構穩定性。本論文以紫外光分光光譜儀探討架橋連接位置、緩衝溶液的酸鹼值、緩衝溶液的種類、以及聚胺類(spermine)的添加,對於核酸三螺旋結構的穩定性影響。
寡核酸序列組合5’-d-(AG)4T4(GA)4 + 5’-d-(CT)4在150 mM NaCl、20 mM MgCl2及20 mM的不同緩衝溶液中,熔點溫度顯示:42.0 ℃ (the phosphate buffer,pH 6.0) ≒ 41.9 ℃ (the MOPSO buffer,pH 6.0) ≒ 41.7 ℃ (the PIPES buffer,pH 6.0) > 32.0 ℃ (the acetate buffer,pH 4.5),此結果表示這一系列的反平行式核酸三螺旋穩定性與緩衝溶液酸鹼值有關,而與緩衝溶液種類較無關係。而另一組寡核酸序列組合5’-d-(AG)4T4(CT)4 + 5’-d-(GA)4經實驗結果發現,在150 mM NaCl、20 mM MgCl2及20 mM的各種緩衝溶液環境中,僅能生成核酸雙螺旋結構-5’-d-(AG)4T4(CT)4之自我摺疊的雙螺旋結構。
聚胺類(spermine)添加對核酸三螺旋結構穩定性的研究顯示:spermine的添加有助於增加反平行式核酸三螺旋結構5’-d-(AG)4T4(GA)4 + 5’-d-(CT)4的穩定性。在acetate buffer (pH 4.5),spermine的添加使熔點溫度上升7.7 ℃;而在pH 6.0的三種緩衝溶液中,spermine對核酸結構穩定度的影響則相對較小,在the phosphate、MOPSO、PIPES buffer中,spermine的添加使熔點溫度分別依序上升2.0 ℃、3.9 ℃及4.2 ℃。
It is the first time in our laboratory studying a triplex with the PuPuPy motif. Two sets of oligomers, 5’-d-(AG)4T4(CT)4 + 5’-d-(GA)4 and 5’-d-(AG)4T4(GA)4 + 5’-d-(CT)4, were designed to form hairpin-type triplex structures with a stem of the same number and composition of base triads, but with a different connecting site of the loop (T4).
In this thesis, the formation of DNA hairpin-type triplexes was monitored by a UV spectrophotometer, and the effects on the structural stability were discussed the loop position, the pH of buffer solutions, the nature of salts, and the addition of spermine.
In the buffer solutions of 150 mM NaCl and 20 mM MgCl2, the melting temperatures of the oligomers 5’-d-(AG)4T4(GA)4 + 5’-d-(CT)4 showed: 42.0 ℃ (in the 20 mM phosphate buffer of pH 6.0) ≒ 41.9 ℃ (in the 20 mM MOPSO buffer of pH 6.0) ≒ 41.7 ℃ (in the 20 mM PIPES buffer of pH 6.0) > 32.0 ℃ (in the 20 mM acetate buffer of pH 4.5). The results revealed that the stability of this anti-parallel DNA triplex is affected by the pH of buffer solutions, but not the nature of salts for buffering solutions. However, the oligomers 5’-d-(AG)4T4(CT)4 + 5’-d-(GA)4 only existed as the DNA duplex under the same conditions mentioned above.
In addition, spermine enhanced the stability of the anti-parallel DNA triplex 5’-d-(AG)4T4(GA)4 + 5’-d-(CT)4. In the acetate buffer of pH 4.5, 5 mM spermine elevated the melting temperature of 7.7 ℃, while it was increased 2.0 ℃ in the phosphate buffer of pH 6.0, 3.9 ℃ in the MOPSO buffer of pH 6.0, and 4.2 ℃ in the PIPES buffer of pH 6.0.
第一章 序論…………………………………………………………… 1
1.1 前言…………………………………………………………… 1
1.2 核酸分子的基本結構………………………………………… 3
1.3 核酸雙螺旋結構……………………………………………… 7
1.4 核酸三螺旋結構……………………………………………… 12
1.5 基因治療的原理與應用……………………………………… 16
1.6 論文研究動機………………………………………………… 18
第二章 核酸螺旋結構之物理性質量測原理……………………… 19
2.1紫外光/可見光分光光譜儀之量測原理及應用……………… 19
2.2比爾定律(Beer’s Law)與核酸濃度的測定…………………… 23
2.3核酸螺旋體之熔點溫度的測定………………………………… 26
第三章 儀器設備與藥品…………………………………………… 30
3.1 儀器設備……………………………………………………… 30
3.2 藥品與試劑…………………………………………………… 31
3.3 緩衝溶液……………………………………………………… 32
第四章 實驗方法與步驟…………………………………………… 33
4.1 寡核酸鏈序列………………………………………………… 33
4.2 實驗條件及樣品製備………………………………………… 36
4.2.1 實驗條件………………………………………………… 36
4.2.2 緩衝溶液的配置………………………………………… 37
4.2.3 核酸雙螺旋的樣品製備………………………………… 38
4.2.4 核酸三螺旋的樣品製備………………………………… 39
4.3 紫外光定波長變溫掃描實驗………………………………… 41
第五章 結果與討論………………………………………………… 42
5.1 紫外光熔點實驗分析………………………………………… 42
5.2 核酸雙螺旋的物性研究……………………………………… 44
5.2.1 髮夾型核酸雙螺旋AG4T4CT4在各種緩衝溶液之影響 45
§ 寡核酸序列AG4T4CT4在acetate buffer (pH 4.5)之影響……… 46
§ 寡核酸序列AG4T4CT4在phosphate buffer (pH 6.0)之影響… 47
§ 寡核酸序列AG4T4CT4在MOPSO buffer (pH 6.0)之影響…… 48
§ 寡核酸序列AG4T4CT4在PIPES buffer (pH 6.0)之影響……… 49
5.2.2 髮夾型核酸雙螺旋AG4T4GA4在各種緩衝溶液之影響 50
§ 寡核酸序列AG4T4GA4在acetate buffer (pH 4.5)之影響……… 51
§ 寡核酸序列AG4T4GA4在phosphate buffer (pH 6.0)之影響… 52
§ 寡核酸序列AG4T4GA4在MOPSO buffer (pH 6.0)之影響…… 53
§ 寡核酸序列AG4T4GA4在PIPES buffer (pH 6.0)之影響……… 54
5.2.3 直鏈型核酸雙螺旋AG4+CT4在各種緩衝溶液之影響… 55
§ 寡核酸序列組合AG4+CT4在acetate buffer (pH 4.5)之影響… 56
§ 寡核酸序列組合AG4+CT4在phosphate buffer (pH 6.0)之影響 57
§ 寡核酸序列組合AG4+CT4在MOPSO buffer (pH 6.0)之影響… 58
§ 寡核酸序列組合AG4+CT4在PIPES buffer (pH 6.0)之影響… 59
5.2.4 架橋(Loop)對於核酸雙螺旋結構穩定性的影響………… 60
5.3 緩衝溶液酸鹼值對核酸三螺旋結構之影響………………… 61
5.3.1 酸鹼值對平行式核酸三螺旋的研究回顧……………… 61
5.3.2 酸鹼值對反平行式核酸三螺旋穩定度之影響………… 63
反平行式核酸三螺旋結構AG4T4CT4+GA4…………………… 64
§ AG4T4CT4+GA4在acetate buffer (pH 4.5)之影響……………… 64
§ AG4T4CT4+GA4在phosphate buffer (pH 6.0)之影響………… 66
§ AG4T4CT4+GA4在MOPSO buffer (pH 6.0)之影響…………… 68
§ AG4T4CT4+GA4在PIPES buffer (pH 6.0)之影響……………… 70
反平行式核酸三螺旋結構AG4T4GA4+CT4…………………… 73
§ AG4T4GA4+CT4在acetate buffer (pH 4.5)之影響……………… 73
§ AG4T4GA4+CT4在phosphate buffer (pH 6.0)之影響………… 74
§ AG4T4GA4+CT4在MOPSO buffer (pH 6.0)之影響…………… 75
§ AG4T4GA4+CT4在PIPES buffer (pH 6.0)之影響……………… 76
5.4 架橋(Loop)位置對於反平行式核酸三螺旋穩定性的影響… 79
5.5 聚胺類的添加對於反平行式核酸三螺旋的影響…………… 82
結論…………………………………………………………………… 86
參考文獻……………………………………………………………… 88
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