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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:葉明鑫
研究生(外文):Ming-hsin Yeh
論文名稱:螢光光譜分析心肌肥厚症之心肌ELC結構變化
論文名稱(外文):Analysis of Structural Change of Myosin Essential Light Chain FHC Mutants by Fluorescence Spectroscopy
指導教授:李惠春
指導教授(外文):Hui-chun Li
學位類別:碩士
校院名稱:慈濟大學
系所名稱:醫學研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:醫學學類
論文種類:學術論文
畢業學年度:95
語文別:中文
論文頁數:62
中文關鍵詞:肌凝蛋白螢光心肌肥厚症肌凝蛋白輕鏈
外文關鍵詞:myosinFHClight chainfluorescence
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心肌肥厚症(familial hypertrophic cardiomyopathy, FHC)是一種遺傳疾病,它是由於肌肉組織中的某些構成肌節的蛋白質發生突變所引起的。明顯特徵是患者的心臟出現肥大的現象,組織學上病患的心肌組織其肌纖維,會出現明顯的不規則的排列狀態,心肌細胞變大,以及結締組織增生的現象。此一疾病的患者有可能終生未出現明顯症狀,有的則會有心絞痛及心律不整的症狀,嚴重時可能會造成患者的猝死。研究顯示此一疾病是因為肌肉組織內構成肌節的蛋白發生突變所引發,其中包括了心肌內的肌凝蛋白(myosin)上的其中一條多胜肽鏈(essential light chain, ELC)。目前這些蛋白質的突變如何導致心肌肥厚的詳細機制還不是很清楚。有可能是因為這些胺基酸突變後的多胜鏈在和其他蛋白質組合成肌節之後影響了肌節的結構或是肌凝蛋白的活性,降低了肌肉的收縮能力,心肌的增生是為了補足收縮力不足。我們為了了解肌凝蛋白的ELC在突變之後對其結構的影響,利用大腸菌合成正常或是帶有點突變的ELC並將其接上化學螢光標記,再將這些ELC取代肌凝蛋白上原有的ELC得到帶有接上螢光標記ELC的肌凝蛋白,最後測量這些帶有正常和突變後ELC的肌凝蛋白其螢光光譜比較其差異以了解這些胺基酸突變後對肌凝蛋白結構和功能的影響。
Muscle contraction depends on the cooperation of the proteins in the sacromere including myosin, actin and other sarcomeric proteins. Mutations of these proteins may affect the normal function of sacromere and muscle contraction. Familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC) is a human autosomal dominant disease characterized by ventricular hypertrophy, myofibrillar disarray, and increasing of loose connective tissue. Arrhythmias and premature sudden cardiac death are common. The disease is caused by missense mutations in nine genes that encode for sarcomeric proteins including myosin essential light chain (ELC). These mutant proteins may incorporate into sarcomere and change the function of the wild-type protein, the structure of myocyte, and the assembly of the sarcomeric filaments. In order to understand the effect of FHC ELC mutation on the structure and function of myosin, we have labeled fluorescence probe on wild type/mutant ELC and exchanged them onto myosin. We used fluorescence spectroscopy to determine the structural difference induced by FHC ELC mutations.
中文摘要 I
Abstract II
目錄 III
表目錄 VII
圖目錄 VIII
1. 緒論 1
1.1. 肌凝蛋白(myosin) 1
1.1.1. 特徵和結構 1
1.1.2. 第二型肌凝蛋白 1
1.1.3. 肌凝蛋白輕鏈和肌凝蛋白收縮的調節 3
1.1.4. ELC的結構及功能 3
1.2. 心肌肥厚症(Familial Hypertrophic Cardiomyopathy, FHC) 4
1.2.1. 病因和可能的致病機制 4
1.2.2. 和心肌肥厚症相關的蛋白質 4
1.2.3. 心肌肥厚症與肌凝蛋白輕鏈 5
1.3. 研究目的及策略 5
1.3.1. 目的及方法 5
1.3.2. 肌凝蛋白的選用 6
1.3.3. 肌凝蛋白輕鏈ELC的選用 6
1.3.4. 心肌肥厚症相關ELC突變點的選用 7
2. 材料與方法 8
2.1. 儀器和藥品 8
2.1.1. 儀器 8
2.1.2. 藥品 9
2.1.3. 純化管柱 9
2.1.4. 套裝試劑 9
2.1.5. 酵素及質體 10
2.2. 豬的心肌肌凝蛋白的純化 10
2.3. 原生型和突變型ELC表達質體的構築 11
2.4. 原生型和突變型ELC的表達和純化 12
2.5. 利用PSIPRED預測突變後之ELC其二級結構 13
2.6. 旋光 (Circular Dichroism) 13
2.6.1. 原理 13
2.6.2. 旋光光譜測定蛋白質的二級結構變化 14
2.6.3. 利用旋光光譜測定原生及突變型ELC的二級結構變化 14
2.6.4. ELC旋光光譜之測量及二級結構分析 15
2.7. 螢光光譜(Fluorescence spectroscopy) 15
2.7.1. 螢光原理 15
2.7.2. 蛋白質結構和螢光 16
2.7.3. 螢光淬熄(Fluorescence quenching) 16
2.7.4. 溶劑可接觸性(Solvent accessibility)和蛋白質結構 16
2.7.5. 溶液可接觸性在本實驗中的應用 17
2.7.6. 在ELC上外接化學螢光物質IAEDANS 17
2.7.7. 螢光光譜及溶劑可接觸性測量 18
2.8. 將ELC置換到肌凝蛋白上 18
2.9. ATP水解酶活性 19
2.9.1. 測量ATP水解酶活性的原理 19
2.9.2. 肌凝蛋白的ATP水解酶活性 19
2.9.3. 肌凝蛋白ATPase活性的測定 19
3. 實驗結果 21
3.1. 利用PSIPRED預測突變後之ELC其二級結構 21
3.2. 以旋光光譜分析游離ELC之二級結構 21
3.3. 螢光光譜分析游離ELC突變後的變化 22
3.4. 將ELC置換到肌凝蛋白並進行ATP水解酶活性的測定 22
3.5. 置換至肌凝蛋白的原生及突變型ELC螢光變化 23
4. 討論與結論 24
4.1. 突變對ELC二級結構的影響 24
4.2. ELC的螢光光譜及溶劑可接觸性 24
4.3. 置換後ELC的光譜和溶劑可接觸性 25
4.4. 討論 26
圖表 27
參考文獻 51
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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