臺灣博碩士論文加值系統

摘要
樟芝(Antrodia cinnamomea)為台灣一種特有的藥用真菌，具有提昇人體免疫力及保肝的多種功能。野生牛樟生長緩慢且不易取得，近年來使用固態或液態培養，期能以較穩定的品質及較合理的價格供應保健食品市場的需求。本實驗採用液態培養，探討不同培養條件(不同碳源及氮源、不同碳源濃度及培養基不同初始pH值的調整) 以搖瓶培養及不同通氣量及攪拌速度在發酵槽培養，對樟芝菌絲體(mycelia)及多醣體(polysaccharides)的生產及多醣品質之影響。
試驗結果顯示在搖瓶培養方面，以葡萄糖及玉米澱粉為碳源和以peptone及corn steep powder為氮源，採用玉米澱粉(3%)和peptone(0.5%)時，可得到最多菌絲乾重、胞外(EPS)及胞內多醣(IPS)分別為1.20 mg/ml 、17.48 mg/ml和0.22 mg/ml，及最佳多醣品質指標包含EPS及IPS之β-1,3-glucan含量分別為8.80 μg/ml LE、1.12 μg/ml LE及分子量3.76×105 Da；在不同碳源濃度試驗(1%、2%及3%)中，則以玉米澱粉2 %時，可得到最多菌絲乾重、胞外(EPS)及胞內多醣(IPS)分別為0.80 mg/ml、9.21 mg/ml及0.13 mg/ml，最佳多醣品質包含EPS及IPS之β-1,3-glucan含量分別為11.62 μg/ml LE及2.68 μg/ml LE；測試不同初始pH值時，以初始pH值未調整(約5.3)可得到最大菌絲乾重、EPS及IPS分別為0.85 mg/ml、14.02 mg/ml及0.07 mg/ml，最佳多醣品質包含EPS及IPS之β-1,3-glucan含量分別為11.06 μg/ml LE及2.54 μg/ml LE。
在5公升的攪拌式發酵槽，進行不同的攪拌及通氣培養條件，以全程維持在100 rpm,1.0 vvm，的生產效果最佳，可得到EPS及IPS產量分別為22.06 mg/ml及 0.28 mg/ml，多醣品質指標包含EPS及IPS之β-1,3-glucan含量分別為21.81 μg/ml LE、2.92 μg/ml LE及分子量1.48×104 Da。

Abstract
Antrodia cinnamomea is an important Chinese medicinal fungus , and is an unique species only grown in Taiwan. It has many functional properties in human body, especially for promoting immune system and protecting liver. As is growing slowly in the wild, supply of A. cinnamomea with stable product quality at reasonable price is in high demand. Research on the methods of artificial cultivation for this fungus is necessary. Our research is interest in attempting to utilize cheaper fermentation substrates for production of this organism, with emphasis on the productivity and quality of the microbial polysaccharides. This study was carried out by submerged fermentation of A. cinnamomea. Culture conditions which including different carbon and nitrogen sources, and different initial pH of fermentation medium in shake flasks. Effects of aeration and stirring in the fermentor were also investigated.
The shake flask studies showed that using of corn starch and peptone combination as carbon and nitrogen sources had the best results in production of biomass, the contents of exo-polysaccharide (EPS) and intra-polysaccharide (IPS), with a concentration of 1.20 mg/ml, 17.48 mg/ml, 0.22 mg/ml, respectively in the fermentation broth. The content of β-1,3-glucan in EPS and IPS were 8.80 μg/ml LE, 1.12 μg/ml LE respectively, and had a molecular weight of 3.76×105 Dalton for EPS. Maximum results were obtained from the medium containing substrate concentration of 2% corn starch and unadjusted initial pH, where the biomass, EPS and IPS contents were 0.85 mg/ml, 14.02 mg/ml, 0.07 mg/ml, respectively, as compared to 1% and 3% starch and initial pH at 3, 4, 5 and 6. And β-1,3-glucan of EPS and IPS are 11.06 μg/ml LE and 2.54 μg/ml LE, respectively.
The results from a 5 liter stirred tank fermentor ran with three different culture conditions showed that it was most suitable at 100 rpm, aeration rate 1.0 vvm throughout the fermentation period, with regard to production and quality of the polysaccharides. EPS and IPS were 22.06 mg/ml, 0.28 mg/ml, respectively. The β-1,3-glucan of EPS and IPS were 21.81 μg/ml LE and 2.92 μg/ml LE. The exo-polysaccharides had molecular weight of 1.48×104 Dalton.

目錄 頁碼
中文摘要..................................................I
英文摘要.................................................II
壹、緒論...................................................1
一、前言...............................................1
二、研究目的...........................................2
貳、文獻回顧...............................................3
一、樟芝及其生物活性成分簡介...........................3
(一) 樟芝多醣體....................................6
(二) β-葡聚醣(β-glucan)的介紹........................8
(三) 三萜類.......................................13
二、菇類的糖質分解酵素................................14
三、菇類的培養........................................16
（一）固態發酵(Solid-state fermentation)................17
（二）液態發酵(Submerged fermentation)...............17
1. 液態培養中球狀菌絲體的形成...................17
2. 菌絲體大小的變化因素.........................18
3. 發酵槽的介紹與分類...........................19
四、玉米澱粉..........................................21
參、材料與方法............................................23
一、實驗菌株..........................................23
二、培養基組成........................................23
三、實驗流程..........................................24
（一）菌種保存....................................24
（二）菌酛培養培養................................25
（三）搖瓶培養....................................25
（四）發酵槽培養..................................26
四、分析方法..........................................27
（一）菌體乾重....................................27
（二）pH值.......................................29
（三）還原醣含量..................................29
（四）澱粉殘留量..................................29
（五）粗多醣含量..................................30
（六）多醣分子量..................................30
（七） β-1,3-glucan含量.............................31
（八）統計分析....................................32
肆、結果與討論............................................33
一、搖瓶培養..........................................33
（一）不同碳源及氮源對於樟芝(A.cinnamomea)培養
之影響.....................................33
1. 對菌絲體生長的影響.........................33
2. 對多醣產量的影響...........................37
3. 對分子量的影響.............................42
4. 對β-1,3-glucan含量的影響....................42
5. 發酵液中還原醣量的變化.....................44
6. 發酵液pH值的變化..........................44
（二）不同碳源濃度對於樟芝(A.cinnamomea)培養
之影響...................................47
1. 對菌絲體生長的影響.........................47
2. 對多醣產量的影響...........................50
3. 對β-1,3-glucan含量的影響....................54
4. 發酵液中還原醣量的變化.....................54
5. 發酵液中殘澱粉量的變化.....................55
6. 發酵液pH值的變化..........................55
（三）不同初始pH值對於樟芝(A.cinnamomea)培養
之影響.....................................59
1. 對菌絲體生長的影響.........................59
2. 對多醣產量的影響...........................59
3. 對β-1,3-glucan含量的影響....................63
4. 發酵液中還原醣量的變化.....................65
5. 發酵液中殘澱粉量的變化.....................67
6. 發酵液pH值的變化..........................67
二、發酵槽培養........................................70
（一）三種不同培養條件在相同發酵槽對於樟芝(A.cinnamomea)培養之影響...................70
1. 對菌絲體生長的影響.........................70
2. 對多醣產量的影響...........................72
3. 對分子量的影響.............................76
4. 對β-1,3-glucan含量的影響....................77
5. 發酵液中還原醣量的變化.....................77
6. 發酵液中殘澱粉量的變化.....................79
7. 發酵液pH值的變化..........................79
（二）搖瓶及發酵槽結果的綜合比較..................82
1. 搖瓶部份...................................82
2. 搖瓶及發酵槽...............................84
伍、結論..................................................85
一、搖瓶培養..........................................85
二、發酵槽培養........................................85
三、搖瓶及發酵槽試驗的比較............................86
陸、參考文獻..............................................87

圖目錄 頁碼
圖一 樟芝(a)子實體形態及樟芝(b)菌絲形態....................5
圖二、有抗腫瘤活性的β-1,6分支的β-1,3-D-葡聚醣結構...........7
圖三、用X射線衍射的β-1,3-D-葡聚醣結晶結構.................10
圖四、活性β-1,3-D-葡聚醣的分子模型.........................11
圖五、β-D-葡聚醣系多醣體抗腫瘤之可能機制..................12
圖六、各種常見之發酵槽....................................20
圖七、發酵槽中的攪拌葉片..................................28
圖八、在agar plate培養1個月的(a)樟芝菌絲型態及在agar broth培養10天的(b)樟芝菌絲體菌酛型態.........................34
圖九、樟芝在不同碳源及氮源組合培養7天的搖瓶結果..........35
圖十、不同碳源及氮源對樟芝菌絲體生長之影響................36
圖十一、不同碳源及氮源對樟芝胞外多醣產量之影響............38
圖十二、不同碳源及氮源對樟芝胞內多醣含量之影響............41
圖十三、不同碳源及氮源對樟芝發酵液還原醣量之影響..........45
圖十四、不同碳源及氮源對樟芝發酵液pH值之影響.............46
圖十五、不同玉米澱粉濃度在第七天之樟芝菌絲體外觀..........48
圖十六、不同玉米澱粉濃度對樟芝發酵期間菌絲生長
之影響.........................................49
圖十七、不同玉米澱粉濃度對樟芝發酵期間胞外多醣產量
之影響.........................................51
圖十八、不同玉米澱粉濃度對樟芝發酵期間胞內多醣含量
之影響.........................................52
圖十九、不同玉米澱粉濃度對樟芝發酵期間還原醣量
之影響.........................................56
圖二十、不同玉米澱粉濃度在樟芝發酵期間殘澱粉量
之變化.........................................57
圖二十一、不同玉米澱粉濃度在樟芝發酵液pH值之變化.........58
圖二十二、不同初始pH對樟芝菌絲生長之影響.................60
圖二十三、不同初始pH對樟芝胞外多醣產量之影響.............61
圖二十四、不同初始pH對樟芝胞內多醣含量之影響.............64
圖二十五、不同初始pH對樟芝發酵液還原醣量之影響...........66
圖二十六、不同初始pH對樟芝發酵液殘澱粉量之影響...........68
圖二十七、不同初始pH在樟芝發酵液pH值之變化..............69
圖二十八、三種不同培養條件在相同發酵槽培養所得
樟芝菌絲體外觀...............................71
圖二十九、不同培養條件在相同發酵槽對樟芝發酵期間胞外多醣產量的影響..........................................73
圖三十、不同培養條件在相同發酵槽對樟芝發酵期間胞內多醣含量的影響..........................................74
圖三十一、不同培養條件在相同發酵槽對樟芝發酵期間發酵液還原醣量的影響........................................78
圖三十二、不同培養條件在相同發酵槽對樟芝發酵期間發酵液之殘澱粉量的影響......................................80
圖三十三、不同培養條件在相同發酵槽對於樟芝發酵期間
發酵液pH 值的變化.............................81

表目錄 頁碼
表一、樟芝子實體中所含三帖類Ergostane型化合物.............15
表二、不同碳源及氮源對樟芝發酵期間菌絲乾重、多醣體產量、多醣體之β-1,3-glucan含量及分子量之影響................39
表三、不同玉米澱粉濃度對樟芝發酵期間菌絲乾重、多醣體產量、多醣體之β-1,3- glucan含量之影響.....................53
表四、不同初始pH值對於樟芝發酵期間菌絲乾重、多醣體產量及多醣體之β-1,3- glucan含量之影響.......................62
表五 不同培養條件在相同發酵槽對於樟芝發酵期間之多醣體產量、多醣體之β-1,3-glucan含量及分子量之影響..............75
表六 搖瓶整理比較(a)及搖瓶及發酵槽整理比較(b).............83

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