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研究生:李婉苓
研究生(外文):Wan-Ling Li
論文名稱:人流感及禽流感核蛋白與宿主細胞蛋白質交互作用的差異及新型抗流感病毒藥物的作用機制
論文名稱(外文):Differences of Cellular Proteins Interacting with Human and Avian Influenza A Viral Nucleoprotein and Mechanistic Study of Novel Anti-influenza Viral Compounds
指導教授:施信如施信如引用關係
指導教授(外文):S. R. Shih
學位類別:碩士
校院名稱:長庚大學
系所名稱:醫學生物技術研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:醫學技術及檢驗學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2008
畢業學年度:96
論文頁數:85
中文關鍵詞:A型流行性感冒病毒核蛋白抗流感病毒藥物
外文關鍵詞:influenza A virusnucleoproteinanti-influenza viral compounds
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如何面對下一波流感大流行為此領域重要的議題,所以本研究專注於探討病毒跨宿主感染及新型抗病毒藥物的作用機制。從本實驗室過去的研究得知,禽流感和人流感之間有15個物種特異性相關的胺基酸差異,這些差異可能導致禽流感或人流感的核蛋白在不同物種的宿主蛋白質有不同的交互作用,因此藉由分析人及禽流感核蛋白與宿主蛋白質交互作用的差異,得知核蛋白在跨宿主感染可能扮演的角色。以免疫沉澱法純化人及禽流感病毒核蛋白,藉此抓下與之交互作用的宿主蛋白質,以一維電泳分析不同來源病毒株核蛋白與宿主蛋白質交互作用的差異。結果在人類293T細胞中,人流感及禽流感核蛋白與宿主蛋白質的交互作用沒有明顯的差異。另外,因抗藥病毒株的產生,研發新型抗病毒藥物是當務之急。此部分的研究目的在找出具對抗流感病毒複製能力的新藥物,以高通量篩選,已鑑定出許多有抑制病毒複製活性的化合物,也以病毒斑抑制試驗及病毒產量試驗確認其抑制效果。以氯黴素乙酰基轉移酶-酵素免疫分析及引子衍生反應分析藥物的作用機制,得知此化合物不論在重組的核醣核蛋白複合體系統或病毒感染的情形下都能抑制病毒mRNA的合成。因此,此化合物或其類似物極具潛力成為以病毒核醣核蛋白複合體為標靶的抗流感病毒藥物。
How to face the next pandemic influenza is an important issue in this field. This study aimed to investigate the mechanisms of crossing species infections and novel anti-viral drugs. Previous study demonstrated that NPs from avian and human influenza viruses contain 15 specie-associated amino acids differences. These differences are likely to result in interspecies interactions of avian and human influenza viral NPs. To investigate the role of NP on interspecies infection, we purified human and avian viral NP proteins and its associating cellular proteins via immunoprecipitation, and applied the protein complexes to one dimensional SDS PAGE and MASS analysis. We found affinity differences between human and avian viral NP associating cellular proteins in human cells. Since the neuraminidase inhibitor resistant viruses have been emerged, we also focused on developing novel anti-influenza drugs targeting to viral RNP. We identified many compounds with anti-influenza viral replication activity by high throughput screening. The inhibitory activities of these compounds were also confirmed by plaque reduction assay and viral yield assay. To further investigate the inhibitory mechanism of these compounds, chloramphenicol acetyltransferase (CAT)-ELISA assay and primer extension assay were used. We found BPR2P0001S0 has effects on viral mRNA synthesis in both RNP transfected cells and virus-infected cell. Therefore, we identified that BPR2P0001S0 or its analogous may be a potential anti-influenza drug based on viral RNP complex.
指導教授推薦書…………………………………………………………...
論文口試委員會審定書…………………………………………………...
長庚大學碩博士論文授權書…………………………………………...iii
致謝……………………………………………………………………...iv
中文摘要………………………………………………………………....v
英文摘要…...............................................................................................vi
目錄……………………………………………………………………..vii
圖表目錄………………………………………………………………...xi
第一章 簡介……………………………………………………………..1
1.1 研究流行性感冒病毒的重要性 - 下一波的流感大流行…....1
1.2 流行性感冒病毒簡介………………………………………….2
1.2.1病毒顆粒結構…………………………………………...2
1.2.2 病毒生活史……………………………………………..3
1.3 分析與人流感及禽流感病毒核蛋白交互作用之宿主細胞蛋白
質的差異………………………………………………………4
1.3.1 第五片段 - 核蛋白(Segment 5 - Nucleoprotein)簡介...4
1.3.2 核蛋白結構……………………………………………..5
1.3.3 核蛋白在病毒生活史中扮演之角色………………......5
1.3.4 核蛋白與病毒跨宿主感染之相關性…………………..6
1.4 分析新型抗病毒藥物-BPR2P0001S0之抗病毒機制………...9
1.4.1 目前已廣泛使用之抗病毒藥物………………………..9
1.4.2 研發新藥的重要性 - 抗藥病毒株的產生…………...10
1.4.3 新型抗病毒藥物 - BPR2P系列藥物………………....11
第二章 研究目的……………………………………………………….13
2.1 分析與人流感及禽流感病毒核蛋白交互作用之宿主細胞蛋白
質的差異……………………………………………………...13
2.2 分析新型抗病毒藥物-BPR2P0001S0之抗病毒機制………..13
第三章 材料與方法…………………………………………………….15
第四章 結果…………………………………………………………….23
4.1分析與人流感及禽流感病毒核蛋白交互作用之宿主細胞蛋白
質的差異……………………………………………………….23
4.1.1 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwan/3446/2002
(H3N2) 以及A/chicken/Taiwan/2000 (H6N1) 病毒株核
蛋白胺基酸序列的差異。.................................................23
4.1.2人流感 (H1N1、H3N2)及禽流感 (H6N1)病毒株之核蛋
白的蛋白質立體結構在residue 397-402以及432-438的
區段有差異性。….............................................................23
4.1.3 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwan/3446/2002
(H3N2)以及A/chicken/Taiwan/2000 (H6N1) 病毒株的
核蛋白在人類293T細胞表現情形無顯著性差異。.....24
4.1.4 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwan/3446/2002
(H3N2)以及A/chicken/Taiwan/2000 (H6N1) 病毒株之
核蛋白在人類293T細胞中,與宿主細胞交互作用之蛋
白質無明顯之差異。…………………………………...24
4.2 分析新型抗病毒藥物-BPR2P0001S0之抗病毒機制………..25
4.2.1 以氯黴素乙酰基轉移酶-酵素免疫分析法(CAT-ELISA
assay)分析化合物BPR2P0001S0、BPR2P0043S0以及
BPR2P0058S0對流行性感冒病毒核醣核蛋白複合體功
能之影響。……………………………………………...25
4.2.2 在重組的病毒核醣核蛋白複合體系統中,
BPR2P0001S0化合物主要會干擾病毒核醣蛋白合成病
毒的mRNA及cRNA。……...........................................27
4.2.3 在病毒感染的情形下,BPR2P0001S0化合物主要會抑
制病毒mRNA及cRNA的合成。…….………………..28
第五章 討論…………………………………………………………….30
圖表……………………………………………………………………...40
參考文獻………………………………………………………………...65
附錄……………………………………………………………………...69

圖表目錄
表一 與流行性感冒病毒核蛋白交互作用之宿主細胞蛋白質.............41
表二 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwan/3446/2002 (H3N2)及A/chicken/Taiwan/2000 (H6N1) 核蛋白胺基酸序列相似度之百分比...............................................................................................................42
表三 本研究使用之人流感及禽流感胺基酸序列的相異點.................43
表四 各化合物之IC50及CC50.................................................................44
表五 BPR2P0001S0化合物抗病毒機制探討之總結............................45
圖一 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwam/3446/2002 (H3N2)及A/Taiwan/chicken/2000 (H6N1) 核蛋白胺基酸序列之差異.................46
圖二 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwam/3446/2002 (H3N2)及A/Taiwan/chicken/2000 (H6N1) 核蛋白蛋白質立體結構之差異.........48
圖三 A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwam/3446/2002 (H3N2)及A/Taiwan/chicken/2000 (H6N1) 核蛋白在人類293T細胞的表現.......49
圖四 在人類293T細胞中,與A/Taiwan/141/2002 (H1N1)、A/Taiwam/3446/2002 (H3N2)及A/Taiwan/chicken/2000 (H6N1) 核蛋白交互作用之宿主細胞蛋白質...................................................................50
圖五 各化合物對病毒核醣核蛋白作用之影響.....................................53
圖六 在重組的病毒核醣核蛋白複合體系統中,BPR2P0001S0化合物對病毒RNA合成的影響.........................................................................55
圖七 在不同病毒力價感染的情形下,BPR2P0001S0化合物對病毒RNA合成的影響......................................................................................57
圖八 固定病毒力價,以不同濃度的BPR2P0001S0化合物處理後,對病毒RNA合成的影響............................................................................59
圖九 BPR2P0001S0化合物抗病毒機制之預測圖- mRNA階段........60
圖十 BPR2P0001S0化合物抗病毒藥物之預測圖- cRNA階段..........61
補充數據 一 免疫沉澱的效率..............................................................62
補充數據 二 BPR2P0001S0化合物能抑制H5N1亞型病毒生長 (感謝香港大學提供).........................................................................................63
補充數據 三 BPR2P0001S0化合物能抑制B型流感及其他RNA病毒的生長,但不能抑制DNA病毒的生長 (感謝本實驗室曾松年先生提供).............................................................................................................64
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