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研究生:陳子甯
研究生(外文):Zih-Ning Chen
論文名稱:評估離子對於等電焦集法的影響
論文名稱(外文):Evaluating the impact of ions isoelectric focusing experiment
指導教授:陳翰民
指導教授(外文):Han-Min Chen
學位類別:碩士
校院名稱:輔仁大學
系所名稱:生命科學系碩士班
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2008
畢業學年度:96
語文別:中文
論文頁數:80
中文關鍵詞:等電焦集法
外文關鍵詞:Isoelectric focusing
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二次元膠體電泳 (Two-dimensional electrophoresis , 2-DE)是一項根據蛋白質的等電點和分子量進行分離的實驗技術,此項技術大量的應用於蛋白質體學研究領域之中。一般而言,二次元膠體電泳成功與否的關鍵因素在於第一次元焦集電泳 (Isoelectric focusing , IEF),而一次元焦集電泳成功與否的關鍵因素取決於樣品所含的鹽類濃度多寡。在本篇論文的研究中,使用了自行研發的一套一次元焦集電泳運算公式,將樣品代入公式可以得到適合該樣品的一次元焦集電泳條件,以確保一次元焦集電泳的品質。實驗ㄧ開始使用導電度計得知樣品鹽濃度之後,再依據實驗所使用的條件如strip的長度以及pH gradient和樣品添加量,一併代入公式運算後,得到一個適合的一次元焦集時間。另一方面,本篇論文也針對鹽類干擾一次元焦集電泳的行為模式做了深入的研究探討,了解離子依照其屬性如強酸強鹼鹽或是弱酸弱鹼鹽等,分別對於一次元焦集電泳產生了不同的影響,本篇研究也在文中提出了相對應的解決之道。
Two-dimensional electrophoresis (2-DE), which is able to simultaneously separate a proteome according to the isoelectric point and molecular weight of individual protein, is probably the most utilized technique in current proteomic researches. In general, the first dimensional electrophoresis procedure, isoelectric focusing (IEF), is considered as a less controllable step in a 2-DE experiment, and prone to be influenced by the residual salts in a prepared 2-DE sample. In this study, to ensure the quality of IEF, we thoroughly examined the influence of salt in IEF, and established an algorithm for optimizing the program design of IEF. Firstly, we proposed to use conductivity meters to monitor the leftover of salts in a 2-DE sample. Secondly, we established an algorithm that deals with the salt content and protein content of a 2-DE sample, as well as the length and pH range of the utilized IPG strip. It was found that for a given 2-DE sample, after applying the above parameters to the established algorithms, a near optimal IEF condition could be reached. On the other hand, in views of simple salts and buffering salts, the interfering mechanisms of salts in IEF were also proposed.
目錄
目錄 -------------------------------------------------------------------------------------------------I
中文摘要 ------------------------------------------------------------------------------------------III
英文摘要------------------------------------------------------------------------------------------IV
第一章 緒論---------------------------------------------------------------------------------5
1.1 蛋白質體學簡介 ------------------------------------------------------------------5
1.2 二次元膠體電泳對於研究的發展與貢獻 ------------------------------------5
1.3 二次元膠體電泳目前面臨的困境 ---------------------------------------------5
1.4 干擾一次元焦集電泳的因素 ---------------------------------------------------7
1.5 實驗動機與目的 ---------------------------------------------------------------- 12
第二章 材料與方法 ------------------------------------------------------------------------- 13
2.1樣品前處理 ------------------------------------------------------------------------- 13
2.1.1細胞破裂法 (freeze and thaw )------------------------------------------- 13
2.1.2血漿白蛋白去除 ---------------------------------------------------------- 14
2.1.3血漿免疫球蛋白去除---------------------------------------------------- 15
2.2 蛋白質沉澱 (Protein precipitation ) --------------------------------------------15
2.2.1三氯醋酸沉澱法 (TCA precipitation) ---------------------------------- 16
2.3蛋白質定量 (Protein quantitation)------------------------------------------------17
2.3.1 Bradford定量法 ------------------------------------------------------------17
2.3.2 BCA定量法 -----------------------------------------------------------------18
2.4二次元膠體電泳 (Two-dimensional electrophoresis)--------------------------19
2.4.1 第一次元電泳 (Isoelectric focusing,IEF)-----------------------------19
2.4.2 IPG膠體平衡反應 (IPG strip equilibration)----------------------------21
2.4.3 第二次元電泳 (Second dimensional electrophoresis) ----------------22
2.5膠體染色 -----------------------------------------------------------------------------24
2.5.1 鋅染色法 (Zinc stain)------------------------------------------------------25
2.5.2 CBR染色法 -----------------------------------------------------------------26
2.5.3 CBG染色法 -----------------------------------------------------------------26
2.6 影像擷取與分析---------------------------------------------------------------------28
2.7 導電度計使用方式----------------------------------------------------------------29
2.8 膠條清洗法---------------------------------------------------------------------------30
第三章 實驗結果與討論 -----------------------------------------------------------------31
3.1 使用導電度計測量樣品之標準流程建立---------------------------------------31
3.2 建立一個預測一次元焦集電泳時間的方程式---------------------------------34
3.2.1 找出七公分電泳系統最少伏特小時數----------------------------------34
3.3使用不同生物樣品測試方程式----------------------------------------------------42
3.3.1 進行不同尺寸IEF電泳的測試-------------------------------------------42
3.3.2 進行不同pH梯度的測試 ------------------------------------------------43
3.3.3 進行不同蛋白質添加量的測試-------------------------------------------43
3.3.4 進行不同物種的測試-------------------------------------------------------44
3.4 去除高鹽樣品對於一次元焦集電泳之影響------------------------------------56
3.4.1低電壓去鹽法 (Electrodesalting) -----------------------------------------56
3.4.2清洗膠條法 (Washing strips) ----------------------------------------------56
3.5 探討鹽類對於一次元焦集電泳之影響------------------------------------------61
3.5.1 不同鹽類對於一次元焦集電泳之影響----------------------------------61
3.5.2 探討正負離子對於一次元焦集電泳之影響----------------------------61
3.6 離子在一次元焦集電泳中的行為模式------------------------------------------64
第四章 結論------------------------------------------------------------------------------------ 72
附錄 ----------------------------------------------------------------------------------------------73
GE IEF相關參數表 ---------------------------------------------------------------------73
表一 GE 一次元焦集電泳時間參數建議表 -----------------------------------73
Bio-Rad IEF相關參數表----------------------------------------------------------------76
表二 Bio-Rad一次元焦集電泳時間參數建議表------------------------------76
圖A: 離子半徑整理圖之ㄧ --------------------------------------------------------77
圖B: 離子半徑整理圖之二 --------------------------------------------------------78
參考文獻 ---------------------------------------------------------------------------------------79
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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