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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:翁愫霙
研究生(外文):Su-Ying Wong
論文名稱:利用脂肪幹細胞植入褐藻膠/奈米陶瓷複合材料結合可降解精密支架於軟骨組織工程之研究
論文名稱(外文):Adipose-derived adult stem cells seeded in alginate-based nanocomposites combined with biodegradable precision scaffolds for cartilage tissue engineering
指導教授:徐善慧徐善慧引用關係
指導教授(外文):Shan-hui Hsu
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:化學工程學系所
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
畢業學年度:96
語文別:中文
論文頁數:70
中文關鍵詞:脂肪幹細胞褐藻膠氫氧基磷灰石TGF-beta 3PLGA精密支架CBD-RGD
外文關鍵詞:adipose-derived adult mesenchymal stem cells (ADAS)nanophase calcium-deficient hydroxy-apatite (nCDHA)alginateTGF-beta 3PLGA precision scaffoldsCBD-RGD
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  本研究先製備一系列nCDHA/alginate奈米複合材料以三維培養方式,探討大鼠脂肪幹細胞經過ㄧ週與二週培養後,軟骨分化基因及軟骨基質分泌 (collagen,GAG) 進行評估,結果發現500 ppm nCDHA可增加第7天軟骨基因分化與第14天膠原蛋白增生。而在100 ppm nCDHA對細胞增生有顯著效果。更進一步,利用500 ppm nCDHA吸附生長因子 (TGF-beta 3) 結合褐藻膠製成之奈米複合材料以三維培養方式,探討大鼠脂肪幹細胞以含TGF-beta 3的軟骨分化劑培養ㄧ週與三週後,結果發現nCDHA吸附TGF-beta 3並以含TGF-beta 3的軟骨分化劑培養大鼠脂肪幹細胞,可增加第7天軟骨基因分化與第21天軟骨基質增生。進一步討論500 ppm nCDHA吸附TGF-beta 3結合alginate應用於PLGA精密支架 (precision scaffolds) 之三維培養,培養21天後,發現軟骨基質明顯增生。此外也評估nCDHA吸附TGF-beta 3/alginate結合CBD-RGD應用於PLGA精密支架,以含TGF-beta 3的軟骨分化劑培養大鼠脂肪幹細胞,可增加第21天軟骨基質增生。本研究建立了一個nCDHA/alginate/PLGA精密支架培養系統,可有效促進軟骨分化。
In this study, the effect of nCDHA on chondrogenic differentiation of rat adipose-derived adult mesenchymal stem cells (ADAS) in alginate gel was evaluated. nCDHA/alginate composites containing different amounts of nCDHA were prepared and used to encapsulate rat ADAS. The chondrogenic differentiation of ADAS was enhanced after 7 days and the total collagen content increased after 14 days at 500 ppm of nCDHA. Cell proliferation was promoted in alginate with 100 ppm of nCDHA. Furthermore, the presence of nCDHA, especially at 500 ppm, in the three dimensional alginate culture induced differentiation of rate ADAS toward chondrogenic phenotype. Furthermore, the combination of growth factor TGF-beta 3 adsorbed onto 500 ppm nCDHA and alginate was used to encapsulate rat ADAS as chondrogenic induction medium. The chondrogenic differentiation of ADAS was enhanced after 7 days and the total collagen content increased after 21 days. The addition of three-dimensional PLGA precision scaffolds and CBD-RGD to chondrogenic induction medium had the same effect on the total collagen content, which increased after 21 days. In this research, we had developed an effective three-dimension culture system for chondrogenesis.
目錄
誌謝 I
摘要 II
Abstract III
表目錄 VIII
圖目錄 X
第一章 文獻回顧 1
1.1 關節軟骨缺損與修復 1
1.1.1 關節軟骨缺損 1
1.1.2 關節軟骨缺損修復 1
1.1.3 軟骨組織工程 (Cartilage tissue engineering) 2
1.2 褐藻酸於軟骨組織工程之應用 3
1.2.1 褐藻酸之化性與物性 4
1.3 幹細胞應用於軟骨組織工程 6
1.4 生長因子對軟骨發生的影響 9
1.5 生醫陶瓷材料 10
1.5.1 奈米生醫陶瓷材料與藥物釋放之應用………………..10
1.6 組織工程精密支架之應用 12
第二章 研究目的 13
第三章 實驗架構、研究方法與材料 14
3.1 實驗架構 14
3.2 大鼠脂肪幹細胞之萃取及培養 15
3.3 三維細胞載體之製作 18
3.3.1 藥品配製 18
3.3.2 褐藻膠微珠之製作 18
3.4 nCDHA吸附生長因子結合褐藻膠之製備 19
3.5 nCDHA/褐藻膠/PLGA精密支架複合材料之製備 20
3.6 nCDHA/褐藻膠/PLGA精密支架複合材料且結合CBD-RGD之製備 22
3.7 nCDHA/alginate奈米複合材料之穿透式電子顯微鏡分析 23
3.8 nCDHA/褐藻膠奈米複合材料之X-ray分析 24
3.9反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR) 分析 24
3.9.1 RNA抽取 24
3.9.2 反轉錄反應 24
3.9.3 聚合酶連鎖反應 25
3.9.4 海藻膠DNA電泳分析 25
3.10 生化分析 27
3.10.1 細胞數分析 27
3.10.2 葡萄糖胺聚合醣分析 (GAG分析) 27
3.10.3 膠原蛋白分析 (Collagen分析) 28
3.11 組織切片染色 28
3.11.1 組織切片製作 28
3.11.2 蘇木紫-伊紅染色 (HE Stain) 29
3.11.3 Alcian blue stain 29
3.11.4 免疫化學染色 30
3.12 統計分析 30
第四章 實驗結果 31
4.1 不同濃度nCDHA/alginate奈米複合材料之影響 31
4.1.1 nCDHA/alginate奈米複合材料之TEM分析 31
4.1.2 nCDHA/alginate奈米複合材料之X-ray分析 31
4.1.3 脂肪幹細胞於褐藻酸微珠培養的分佈及生長之分析 31
4.1.4 nCDHA/alginate奈米複合材料對脂肪幹細胞基因表現之分析 32
4.1.5 nCDHA/alginate奈米複合材料對脂肪幹細胞基質分泌之分析 32
4.2 nCDHA吸附生長因子結合褐藻膠三維培養對脂肪幹細胞之軟骨發生能力 32
4.2.1 脂肪幹細胞於褐藻膠微珠之基因表現分析 32
4.2.2 脂肪幹細胞於褐藻膠微珠之基質分泌分析 33
4.3 nCDHA/alginate/PLGA精密支架三維培養對脂肪幹細胞軟骨發生能力之影響 33
4.3.1 精密支架外觀型態觀察與精密支架中細胞生長之分析 33
4.3.2 脂肪幹細胞於精密支架中基質分泌之分析 34
4.3.3 脂肪幹細胞結合CBD-RGD於精密支架中基質分泌之分析 34
4.3.4 精密支架組織切片之分析 34
第五章 討論 36
第六章 結論 40
參考文獻 41

表目錄
表1 不同組織萃取得間質幹細胞表面抗原之比較 8
表2 HBSS緩衝溶液成份 16
表3 rADAS之培養液成份 17
表4 nCDHA吸附TGF-beta 3結合褐藻膠之實驗設計 20
表5 軟骨分化劑成份 20
表6 nCDHA/褐藻膠/PLGA精密支架複合材料之實驗設計 22
表7 nCDHA/褐藻膠/PLGA精密支架複合材料並且結合CBD-RGD之實驗設計 23
表8 聚合酶連鎖反應試液 (Gene Mark) 25
表9 半定量 (semi-guantitative) RT-PCR 引子設計 26
表10 不同濃度nCDHA/alginate三維培養之細胞數分析 (n=3) 49
表11 不同濃度nCDHA/alginate三維培養14天後,每單位細胞數之GAG含量分析 (n=3) 49
表12 不同濃度nCDHA/alginate三維培養14天後,每單位細胞數total collagen之含量分析 (n=3) 49
表13 以500 ppm nCDHA/alginate三維培養,ADAS誘導軟骨分化21天後,每顆微珠之GAG含量分析 (n=3) 50
表14 以500 ppm nCDHA/alginate三維培養,ADAS誘導軟骨分化21天後,每顆微珠之total collagen含量分析 (n=3) 50
表15 以500 ppm nCDHA/alginate結合精密支架三維培養,ADAS誘導軟骨分化21天後,每個支架之GAG含量分析 (n=3) 51
表16 以500 ppm nCDHA/alginate結合精密支架三維培養,ADAS誘導軟骨分化21天後,每個支架之total collagen含量分析 (n=3) 51
表17 以500 ppm nCDHA/alginate並且添加RGD結合精密支架三維培養,ADAS誘導軟骨分化21天後,每個支架之GAG含量分析 (n=3) 52
表18 以500 ppm nCDHA/alginate並且添加RGD結合精密支架三維培養,ADAS誘導軟骨分化21天後,每個支架之total collagen含量分析 (n=3) 52

圖目錄
圖1 軟骨組織工程上使用之缺損修復策略,結合組織工程三要素細胞、支架、訊號之體外培養至移植手術 3
圖2 褐藻酸結構與鍵結方式 4
圖3 褐藻酸與金屬離子螯合凝膠過程 6
圖4 間質幹細胞的多向分化潛能 7
圖1 實驗架構圖…………………………………………………………14
圖6 精密支架的構形,(a) 支架之Φn、dh;(b) 支架之4D結構 21
圖7 PCR反應溫度曲線圖 26
圖8 不同比例nCDHA/alginate奈米複合材料之TEM觀察 53
圖9 不同比例nCDHA/alginate奈米複合材料之X-ray繞射分析 54
圖10 褐藻膠微珠型態,微珠直徑約為2 mm 55
圖11 細胞在褐藻膠微珠中分布情況 55
圖12 不同濃度nCDHA/alginate奈米複合材料三維培養之細胞生長曲線圖 56
圖13 RT-PCR電泳膠片圖。不同濃度nCDHA/alginate奈米複合材料三維培養,細胞培養7天之基因表現分析 56
圖14 RT-PCR基因表現程度量化圖。不同濃度nCDHA/alginate奈米複合材料三維培養,細胞培養7天之基因表現分析 57
圖15 不同濃度nCDHA/alginate奈米複合材料三維培養,細胞培養14天基質分泌之分析 58
圖16 RT-PCR電泳膠片圖。500 ppm nCDHA 吸附TGF-beta 3 結合alginate之三維培養,細胞培養7天之基因表現分析 59
圖17 RT-PCR基因表現程度量化圖。500 ppm nCDHA 吸附TGF-beta 3 結合alginate之三維培養,細胞培養7天之基因表現分析 60
圖18 500 ppm nCDHA 吸附TGF-beta 3 結合alginate之三維培養,細胞培養3天之基因表現分析 (n=3),(a) RT-PCR電泳膠片;(b) 基因表現程度量化圖 61
圖19 500 ppm nCDHA 吸附TGF-beta 3 結合alginate之三維培養,細胞培養21天基質分泌之分析 62
圖20 剛植入細胞 (第0天) 於PLGA精密支架中之支架型態 63
圖21 培養21天後,PLGA精密支架型態 64
圖22 nCDHA/alginate/PLGA精密支架之三維培養,細胞之生長曲線圖 65
圖23 nCDHA/alginate/PLGA精密支架之三維培養,細胞培養21天後基質分泌之分析 66
圖24 nCDHA/褐藻膠/PLGA精密支架複合材料且結合CBD-RGD之三維培養,細胞培養21天後基質分泌之分析 67
圖25 nCDHA/alginate/PLGA精密支架之三維培養,以軟骨分化劑 (TGF-beta 3) 培養後之基質染色,HE染色 68
圖26 nCDHA/alginate/PLGA精密支架之三維培養,以軟骨分化劑 (TGF-beta 3) 培養後之基質染色,Alcian blue染色 69
圖27 nCDHA/alginate/PLGA精密支架之三維培養,以軟骨分化劑 (TGF-beta 3) 培養後之基質染色,第二型膠原蛋白免疫染色 70
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