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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:施幸蓉
研究生(外文):Hsing-Jung Shih
論文名稱:利用重組菌生產之胞外生澱粉水解酵素水解甘藷生粉以生產生質酒精
論文名稱(外文):Utilization of the sweet potato raw starch by recombinant raw starch digesting amylase for producing bioethanol
指導教授:蔡碩文蔡碩文引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:食品暨應用生物科技學系
學門:醫藥衛生學門
學類:營養學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2008
畢業學年度:96
語文別:中文
論文頁數:101
中文關鍵詞:生澱粉水解酵素甘藷生質酒精
外文關鍵詞:raw-starch-digesting amylasesweet potatobioethanol
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一般澱粉加工的方式可以分成兩步驟,首先將澱粉經高溫糊化作用後以α-amylase催化進行液化,然後在液化後利用glucoamylase進行糖化。本研究利用轉入質體帶有生澱粉水解酵素 (RSDA) 基因之Bacillus subtilis DB430 (pHR) 重組菌株,生產具有水解生澱粉活性之胞外酵素,在低溫環境下直接作用於未經糊化的甘藷生粉,以節省澱粉加工時的能源消耗。

台農57號甘藷所製成的甘藷生粉含有84%的碳水化合物,是台灣生產生質酒精的候選作物之一。Bacillus subtilis DB430 (pHR) 菌株在培養2天後可以達到大約 6.5 U/mL左右的最高酵素活性,經離心將粗酵素液直接加入 20% 未經糊化的台農57號甘藷生粉中,最多可以產生36 g/L的葡萄糖。再加入glucoamylase幫助水解之後,葡萄糖的產量可以比僅有RSDA作用的狀況再增加308%。然而基質並沒有經過高溫滅菌且在未達其澱粉糊化溫度78℃以下進行生澱粉水解,所以在較低的操作溫度下會有雜菌汙染的問題,而影響葡萄糖的含量。

選擇糖化過程中葡萄糖含量較高的條件不經滅菌即接入Saccharomyces cerevisiae BCRC 21679進行酒精發酵。在酒精發酵的過程中,澱粉水解酵素仍持續作用。水解環境的溫度越高,達到目標酒精度所需的後續發酵時間較短;低溫環境下水解,所需發酵時間則較長。甘藷生粉全程在30℃環境下進行糖化及發酵84小時之後,可以達到 7.5% 的酒精產量。本研究提出的製程可以在熱帶及亞熱帶環境直接置於室溫下進行水解及發酵,以減少能源的消耗,有利於成本競爭。
Starch is converted into simple saccharides in two steps in conventional process. For the first step, hydrated starch is gelatinized by heat at the first stage and liquefied by α-amylase at the second stage. After the first step, the liquefied starch is saccharified by glucoamylase. In this research, raw starch digesting amylase (RSDA) which produced by recombinant Bacillus subtilis DB430 is adopted for directly utilizing the raw starch of sweet potato under low temperature condition, which is expected to reduce the energy consumption during processes.

Tainon 57 sweet potato, one of the potential energy crops in Taiwan, which powder includes 84% carbohydrate is considered as suitable substrate for bioethanol production. After 2 days incubation, harvested exoenzyme RSDA from Bacillus subtilis DB430 with the recombinant plasmid pHR showed the best enzyme activity, around 6.5 U/mL. Crude RSDA is added into 20% ungelatinized Tainon 57 sweet potato powder for hydrolyzation and achieve the highest glucose yield 36 g/L. When RSDA crude enzyme catalyzed in coordination with glucoamylase, the glucose yield was increased 308%. Since the whole process is operated under the gelatinized temperature 78℃ and without sterilization, the microbial contamination effects on the glucose yield under low temperature process.

The hydrolyzing condition lead to better glucose yield was chosen to inoculate Saccharomyces cerevisiae BCRC 21679 without prior sterilizing to ferment the hydrolyzed substrate into ethanol. The starch is simultaneously hydrolyzed during the fermentation process. When hydrolysis processes at higher temperature, the produced ethanol achieves objective concentration in short time; the result is reversed when working under lower temperature. 7.5% ethanol can be achieved after total 84 hours processes thorugh 30℃. The results suggest the whole process can be operated under room temperature in the tropics or subtropics and show the potential to reduce the energy cost in the process.
目錄
中文摘要
英文摘要

目錄........... I
圖目錄......... IV
表目錄......... VI
第一章 前言.... 1
緒論........... 1
一、生質酒精... 1
1、生質能源的發展...... 1
2、生質酒精的介紹...... 2
3、以澱粉生產生質酒精.. 6
二、生澱粉水解酶之介紹..8
1、生澱粉水解酶之特性.. 8
2、生澱粉水解酶之作用機制...... 10
3、生澱粉水解酶之應用.......... 10
三、以甘藷為原料生產生質酒精... 13
1、台灣發展生質酒精之策略...... 13
2、台灣利用甘藷生產生質酒精之計畫...... 14
四、研究動機與目的..................... 16
第二章 材料與方法...... 17
一、實驗設計與流程..... 17
二、實驗材料........... 20
1、試驗菌種及質體...... 20
2 、澱粉樣品及澱粉水解酵素..... 21
3、化學藥品及培養基.... 21
4、儀器設備............ 24
三、實驗方法........... 26
1、甘藷樣品製備........ 26
2、樣品成份分析........ 26
2.1、台農57號甘藷粉成份分析.... 26
2.2、糊化溫度測定...... 30
2.3、甘藷生粉之生菌數測定...... 30
3、菌株及質體條件...... 31
3.1、生澱粉水解酵素重組質體 (pHR) 的轉形操作............31
3.2、Bacillus subtilis DB430 (pHR) 轉形菌株之確認及篩選.32
3.3、Bacillus subtilis DB430 轉形菌株質體DNA之抽取.....32
3.4、Bacillus subtilis DB430 (pHR)之生長曲線.........33
3.5、酵素活性分析......33
3.6、粗酵素液的製備....34
3.7、重組生澱粉水解酵素之生化性質分析..................35
4、粗酵素液水解甘藷粉.. 36
4.1、利用重組粗酵素液水解純化之甘藷澱粉................36
4.2、重組粗酵素液與商業酵素水解純化甘藷澱粉之比較......36
4.3、重組粗酵素液作用於台農57號甘藷粉之最適粗酵素添加量.37
4.4、重組粗酵素液作用於台農57號甘藷粉之最適基質添加量.. 37
4.5、利用粗酵素液與添加的glucoamylosidase水解對台農57號甘藷粉作用....37
5、利用粗酵素液水解甘藷粉實驗之條件進行酒精發酵......38
5.1、酵母菌的馴養....................................38
5.2、酒精發酵實驗....................................38
第三章 結果與討論...... 41
一、甘藷生粉之分析結果..41
1、成份分析.............41
2、糊化溫度.............41
3、生菌數之測定.........42
二、Bacillus subtilis DB430 (pHR)轉形菌株與RSDA粗酵素液之測試與分析....44
1、Bacillus subtilis DB430 (pHR)轉形菌株..............44
2、RSDA粗酵素液之分析.................................47
三、酵素水解甘藷生粉之結果............................52
1、利用重組生澱粉水解粗酵素液以及商用酵素水解純化之甘藷澱粉52
2、重組粗酵素液與Glucoamylase 共同作用水解甘藷生粉....56
四、酒精發酵之結果....................................79
1、不同水解條件後行酒精發酵之比較.....................79
2、理論能源消耗量及糖化率之換算.......................89
第四章 結論與未來展望.................................96
一、結論..............................................96
二、未來展望..........................................97
參考文獻..............................................98


圖目錄
圖 1、以不同原料製作生質能源的流程 ...................2
圖 2、澱粉水解酵素之分類..............................7
圖 3、雙向載體-pHR....................................20
圖 4、DNS法之葡萄糖標準曲線..........34
圖 5、液相層析儀之葡萄糖、果糖以及蔗糖標準曲線.........39
圖 6、氣相層析儀之酒精標準曲線.........................40
圖 7、澱粉樣品之RVA黏度曲線。(A)購自Wako之甘藷澱粉,(B)台農57號甘藷生粉...............43
圖 8、B. subtilis DB430 (pHR)電轉轉形株之篩選及其限制酶剪切電泳圖之確認...............45
圖 9、以碘液染色確認B. subtilis DB430與B. subtilis DB430 (pHR)重組質體轉形株之澱粉水解活性.....46
圖 10、 Bacillus subtilis DB430 (pHR) 之生長曲線.........48
圖 11、於不同時間取樣觀察B. subtilis (pHR)生產之生澱粉水解酵素的活性........................... 49
圖 12、B. subtilis (pHR)生產之生澱粉水解酵素之 (A)以可溶性澱粉作為基質之最適溫度、(B) 以甘藷生澱粉作為基質之最適溫度、(C) 最適pH值、(D) 熱穩定性、(E) pH穩定性及 (F) 低溫儲藏之安定性..................................51
圖 13、RSDA粗酵素液在不同溫度下對純甘藷澱粉之糖化效果.....54
圖 14、比較RSDA粗酵素液與商用天野澱粉水解酵素在40℃(A)、50℃(B)下對甘藷生澱粉之水解糖化效果....55
圖 15、不同之酵素活性的粗酵素液(A)在30℃下對甘藷生粉水解之葡萄糖產量及對pH值的影響(B)..........58
圖 16、不同之酵素活性的粗酵素液(A)在40℃下對甘藷生粉水解之葡萄糖產量及對pH值的影響(B)..........59
圖 17、在30℃下添加2 U/mL RSDA粗酵素液對於不同濃度之甘藷生粉水解糖化所產生的葡萄糖濃度(A)和造成pH值的影響(B)...........62
圖 18、在40℃下添加2 U/mL RSDA粗酵素液對於不同濃度之甘藷生粉水解糖化所產生的葡萄糖濃度(A)和造成pH值的影響(B)...........63
圖 19、在50℃下添加2 U/mL RSDA粗酵素液對於不同濃度之甘藷生粉水解糖化所產生的葡萄糖濃度(A)和造成pH值的影響(B)...........64
圖 20、添加RSDA粗酵素液與水解6小時後加入glucoamylase於不同濃度甘藷生粉在30℃下水解糖化之葡萄糖產量(A)和pH值(B)的變化...69
圖 21、添加RSDA粗酵素液與水解6小時後加入glucoamylase於不同濃度甘藷生粉在40℃下水解糖化之葡萄糖產量(A)和pH值(B)的變化...70
圖 22、添加RSDA粗酵素液與水解6小時後加入glucoamylase於不同濃度甘藷生粉在50℃下水解糖化之葡萄糖產量(A)和pH值(B)的變化...71
圖 23、於反應最初同時添加RSDA粗酵素液與glucoamylase於不同濃度甘藷生粉在30℃下水解糖化之葡萄糖產量(A)和pH值(B)的變化....72
圖 24、於反應最初同時添加RSDA粗酵素液與glucoamylase於不同濃度甘藷生粉在40℃下水解糖化之葡萄糖產量(A)和pH值(B)的變化....73
圖 25、於反應最初同時添加RSDA粗酵素液與glucoamylase於不同濃度甘藷生粉在50℃下水解糖化之葡萄糖產量(A)和pH值(B)的變化....74
圖 26、甘藷生粉在30℃下水解12小時後接種酵母菌進行酒精發酵的結果................................82
圖 27、甘藷生粉在30℃下水解16小時後接種酵母菌進行酒精發酵的結果................................83
圖 28、甘藷生粉在40℃下水解9小時後接種酵母菌進行酒精發酵的結果................................84
圖 29、甘藷生粉在40℃下水解12小時後接種酵母菌進行酒精發酵的結果................................85
圖30、甘藷生粉在50℃下水解12小時後接種酵母菌進行酒精發酵的結果................................86
圖31、、甘藷生粉在50℃下水解24小時後接種酵母菌進行酒精發酵的結果................................87
圖 32、不同水解條件下糖化甘藷生粉後進行酒精發酵之反應時間與酒精產量的關係.......................90

表目錄
表1、發酵生產酒精之主要酵母菌........................4
表2、不同的澱粉顆粒之結構與水解之難易度..............8
表3、生產生澱粉水解酵素之微生物及其來源..............9
表4、生澱粉水解作用之研究與發展......................12
表5、五種生質酒精作物最適栽培期及生質酒精轉換比較....15
表6、澱粉水解之實驗流程..............................18
表7、酒精發酵之實驗流程..............................19
表8、甘藷生粉之成份分析..............................42
表9、不同酵素水解條件在30℃下糖化甘藷生粉產生的葡萄糖最高產量...76
表10、不同酵素水解條件在40℃下糖化甘藷生粉產生的葡萄糖最高產量...77
表11、不同酵素水解條件在50℃下糖化甘藷生粉產生的葡萄糖最高產量...78
表12、發酵初期之微生物可利用碳水化合物含量............80
表13、甘藷生粉在六個不同水解條件糖化後進行酒精發酵48小時之酒精度................88
表14、假設室溫25℃理想狀態下水解甘藷生粉後發酵到達一定的酒精度所需之能源換算....91
表15、假設室溫30℃理想狀態下水解甘藷生粉後發酵到達一定的酒精度所需之能源換算....92
表16、糖化率之計算.........94
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