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研究生:陳星宇
研究生(外文):Hsin-Yu Chen
論文名稱:台灣蜆熱水萃取物之抗氧化活性及其有效成分
論文名稱(外文):Approach to Antioxidant Activity and Related Compounds in Hot Water Extract of Freshwater Clam
指導教授:駱錫能駱錫能引用關係
指導教授(外文):Shyi-Neng Lou
學位類別:碩士
校院名稱:國立宜蘭大學
系所名稱:食品科學系碩士班
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2008
畢業學年度:97
語文別:中文
論文頁數:113
中文關鍵詞:台灣蜆抗氧化性熱水萃取層析劃分有效物質
外文關鍵詞:Corbicula flumineaAntioxodant activityHot-water extractchromatographic separation and fractionbioactive compounds
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台灣蜆 (Corbicular fluminea) 於民間傳統飲食中被視為具有保肝之療效,同時亦具有抗氧化、抑制腫瘤及抗發炎等其他相關生理功能。本研究探討不同熱水萃取時間對台灣蜆萃取物之抗氧化活性差異,再以管柱層析劃分收集後,分析鑑定蜆熱水萃取物中之有效抗氧化成分。
結果顯示,不同加熱時間之蜆熱水萃取物其DPPH自由基清除率、還原力及螯合亞鐵能力皆隨著濃度增加而有上升。比較熱水萃取物之半抑制濃度(IC50)時,DPPH清除率和還原力皆以40 min熱水萃取物為最佳,其值分別為1.82 mg/mL和10.53 mg/mL。另外在單位時間內降低IC50能力中,DPPH清除率及還原力在20-40 min內之效果最佳,分別降低0.023及0.733 IC50/g/min。因此,實驗先選取40 min熱水萃取物為後續抗氧化活性研究之主要部份。
養殖蜆及野生蜆之40 min 熱水萃取物,經由膠過濾層析法 (superose 12 prep)分離為四個劃分區, A區( > 1300 Da),B區(1300-630 Da),C區(630-240 Da)和D區( < 240 Da)。其中以劃分物B及C區具最強之DPPH自由基有效清除率,養殖蜆分別為20.28 及18.99 %/mg/mL,野生蜆則為21.03及17.22 %/mg/mL,由於劃分C區之固形物含量較B區高,因而選擇劃分物C區再以半製備型管柱進行分離。
經由半製備型管柱分離後養殖蜆共可得9個劃分物,其中以CFC-HW40-C-IV、III及VIII等3個劃分物具最高之DPPH自由基有效清除率,分別為323.40、140.13及145.98 %/mg/mL,佔CFC-HW40-C劃分物之60 %的抗氧化活性。此外,野生蜆經分離後可得到5個劃分物,其中以FFC-HW40-C-V、III及II等3個劃分物之DPPH自由基有效清除率最強,分別為83.94、71.44及64.61 %/mg/mL,佔FFC-HW40-C劃分物之80 %的抗氧化活性。進一步以分析型管柱分離蜆半製備型管柱劃分物,得知養殖蜆之CFC-HW40-C-III及IV區劃分物含有5`-UMP及5`-IMP,而VI區中分別發現含有5`-AMP及5`-GMP等核酸物質,在IX區中則發現有trosine之存在。另外,野生蜆劃分物FFC-HW40-C-II中,經分析後確認含有5`-UMP及5`-IMP,而III區劃分物中亦鑑定出2種核酸物質,分別為5`-AMP及5`-GMP,最後在V區中偵測到tyrosine。
經由比對已鑑定物質之抗氧化活性,發現tyrosine確實具有清除DPPH自由基之能力,顯示含tyrosine之相關物質可能在蜆之抗氧化性扮演重要之角色,其餘之核苷酸物質則與抗氧化貢獻並無相關。
Hot water extract of freshwater clam (Corbicular fluminea) was traditionally claimed hepatoprotective activity, antioxidant activity, anti-cancer, anti-inflammatory effect and other relevant physiological functions. The aim of this study was to evaluate the effect of extraction on antioxidant activity and to separate and collect the extract by semi-preparative chromatography. The obtained fractions were subjected to the HPLC analysis to identify the major antioxidant compounds.
The results indicated that DPPH radical scavenging effect, reducing power, and chelating Fe2+ ability of hot water extracts increased with increasing concentration. The lowest values of 50% inhibitory concentration (IC50) on DPPH radical scavenging effect (1.82 mg/mL) and reducing power (10.53 mg/mL) were found in 40 min extract. The highest reducing effect of IC50 on DPPH radical scavenging effect and reducing power were observed during 20 to 40 min cooking. The decreasing ratio were 0.023 and 0.733 IC50/mg/mL, respectively. Therefore, the extract of 40 min cooking was selected and subjected to the following analysis.
The extracts of Cultured freshwater clam (CFC) and Field freshwater clam (FFC) after cooking for 40 min were separated to four fractions by a superpose 12 prep. gel filtration chromatography. The fraction molecular weight range was Fraction A ( > 1300 Da), Fraction B (1300-630 Da), Fraction C (630- 240 Da) and Fraction D (< 240 Da). The DPPH radical scavenging potency of fraction B and C were 20.28 and 18.99 %/mg/mL in CFC, while these were 21.03 and 17.22 %/mg/mL in FFC, respectively. The fraction C was chosen to identify the antioxidant compounds by semi-preparative chromatography method. Nine fractions of the obtained CFC fraction C (CFC-HW40-C) were separated by semi-preparative reversed-phase HPLC. The fractions of CFC-HW40-C-IV、III and VIII had high DPPH radical scavenging potency with the value of 323.40, 140.134, and 145.98 %/mg/mL, respectively. The sum of these three fractions contributed 60 % antioxidant activity in the fraction of CFC-HW40-C. Similarly, five fractions of FFC-HW40-C were collected. The DPPH scavenging potency of three fractions, such as FFC-HW40-C-V, III and II, contained high value, which equal to 83.94, 71.44, and 64.61 %/mg/mL, respectively. The 80% antioxidant activity of FFC-HW40-C was due to these three fractions. It was found that the 5`-UMP and 5`-IMP existed in fractions of CFC-HW40-C-III and IV, respectively. The fraction of CFC-HW40-C-VI consisted two nucleotides, such as 5`-AMP and 5`-GMP. However, the main peak in fraction of CFC-HW40-C-IX was identified as tyrosine. For the fraction of FCF-HW40-C, 5`-UMP and 5`-IMP were found in the fraction of FFC-HW40-C-II, 5`-AMP and 5`-GMP in the fraction of FFC-HW40-C-III. Tyrosine was the major peak in the fraction FFC-HW40-C-V.
After compare with the standard compounds for the DPPH radical scavenging effect, tyrosine indeed contained DPPH radical scavenging ability, while no DPPH radical scavenging ability of nucleotodes were observed. This implied that the tyrosine related compounds might play an important role for the antioxidant activity in freshwater clam.
中文摘要 II
英文摘要 IV
壹、前言 1
貳、文獻回顧 3
一、台灣蜆 3
(一) 品種與分佈 3
1. 台灣蜆之分類地位 3
2. 台灣蜆之分佈 3
(二) 養殖情況及經濟價值 4
1. 養殖情況 4
2. 台灣蜆之特性 5
3. 經濟價值 5
二、蜆的營養成份及生理活性 6
(一) 一般成分及其他相關化學物質 6
1. 一般成份 6
2. 其他相關化學物質 6
(二) 蜆之生理活性功能 7
1. 抗氧化性 7
2. 抗癌作用 8
3. 保肝作用 9
三、蜆之生理活性相關物質 11
(一) 胜肽 11
1. 降血壓胜肽 11
2. 抗氧化胜肽 12
(二) 游離胺基酸 (Free amino acid,FAA) 16
(三) 核苷酸相關物質 16
(四) 類胡蘿蔔素 17
(五) 葉綠素 18
(六) 固醇類 19
(七) 肝醣 19
參、實驗架構 21
一、不同加熱時間蜆熱水萃取物之抗氧化活性評估 21
二、蜆熱水萃取物之抗氧化有效成分之劃分及初步鑑定 22
肆、材料與方法 23
一、材料 23
(一) 實驗材料 23
(二) 藥品及器材 23
1. 化學藥品 23
2. 器材 24
二、實驗方法 25
(一) 蜆熱水萃取物之製備 25
(二) 抗氧化活性評估方法 26
1. DPPH自由基清除能力測定 26
2. 還原力測定 26
3. 螯合亞鐵離子能力測定 27
4. 抑制血紅蛋白催化亞麻油酸過氧化能力測定 27
5. 抗氧化評估方法之IC50測定 28
(三) 膠體過濾層析劃分 28
1. Superose 12 膠體過濾層析法 28
2. 膠過濾劃分物收集及清除DPPH自由基能力測定 29
3. 劃分物之相關物質初步分析 29
(1) 胜肽含量 29
(2) 總葉綠素 30
(3) 總類胡蘿蔔素 30
(四) 高效能液相層析法 30
1. 半製備型管柱層析劃分 30
2. 半製備型管柱劃分物收集及清除DPPH自由基能力測定 31
3. 分析型管柱層析分離 31
(五) 鑑定高效液相層析劃分物之抗氧化物質之特性 32
1. 相關物質之比對 32
(1) 核酸相關物質分析方法 32
(2) 胺基酸及胜肽物質 33
2. LC/MS推測各劃分物之特性 33
伍、結果與討論 34
一、 不同加熱時間蜆熱水萃取物之抗氧化活性評估 34
(一) DPPH自由基清除能力 34
(二) 還原力 35
(三) 螯合亞鐵能力 36
(四) 抑制血紅蛋白催化亞麻油酸過氧化之能力 36
(五) 熱水萃取對蜆清除DPPH自由基能力之影響 37
(六) 熱水萃取對蜆提供還原力之影響 39
(七) 熱水萃取對蜆提供螯合亞鐵能力之影響 40
(八) 熱水萃取對蜆提供抑制亞麻油酸過氧化能力之影響 40
二、蜆熱水萃取物之抗氧化有效成分之分離 41
(一) Superose膠過濾層析劃分 41
1. 養殖蜆熱水萃取物之劃分物及清除DPPH自由基能力 41
2. 野生蜆熱水萃取物之劃分物及清除DPPH自由基能力 43
3. 劃分物相關物質之初步分析 44
(二) 半製備型管柱層析劃分 45
1. 養殖蜆膠過濾層析劃分物分離及清除DPPH自由基能力測定 45
2. 野生蜆膠過濾層析劃分物分離及清除DPPH自由基能力測定 46
三、蜆熱水萃取物之抗氧化相關物質之初步鑑定 48
(一) 以RP-HPLC分離劃分物之成分 48
1. 養殖蜆劃分物 48
2. 野生蜆劃分物 50
(二) 核苷酸相關物質之分析 52
(三) 胺基酸及胜肽物質之分析 53
(四) 蜆熱水萃取物經鑑定之物質與劃分物抗氧化活性之關係 55
陸、結論 57
柒、參考文獻 59
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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