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研究生:林志明
研究生(外文):Chih-Ming Lin
論文名稱:ZymomonasmobilisATCC29191轉化葡萄糖成生質乙醇之培養基開發與固定化發酵策略探討
論文名稱(外文):Development of optimal medium of Zymomonas mobilis ATCC29191 to production of bioethanol by catabolism of glucose and immobilization fermentation strategy
指導教授:蘇文達蘇文達引用關係
口試委員:陳文章魏毓宏
口試日期:2008-06-26
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺北科技大學
系所名稱:化學工程研究所
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2008
畢業學年度:96
語文別:中文
論文頁數:69
中文關鍵詞:Zymomonas mobilis培養基最適化回應曲面法葡萄糖轉化生質乙醇
外文關鍵詞:Zymomonas mobilisoptimal mediumResponse Surface Methodologyglucose catabolismbioethanol
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Zymomonas mobilis為格蘭氏陰性兼性厭氧菌,在無氧條件下將利用Entner- Doudoroff pathway代謝醣類並轉化成乙醇。Zymomonas mobilis轉化葡萄糖成乙醇,具高理論產率及轉化率等優點,非常適合於乙醇工業化大量生產。本研究主要目的,係開發Zymomonas mobilis轉化葡萄糖成乙醇之最適化培養基。研究證實Z. mobilis ATCC 29191在以葡萄糖(150 g/L)為碳源、(NH4)2SO4 (1 g/L)為氮源之培養基,經四十小時培養,可得最高乙醇濃度、產率及理論轉化率,分別達64.70 g/L、1.61 g/L/h與84.39 %。進一步研究顯示,以(NH4)2HPO4 (1 g/L) 取代(NH4)2SO4 (1 g/L),不僅大幅提升產物乙醇之產率達2.69 g/L/h,同時可維持乙醇之高轉化率84.44 %。其次,本研究利用回應曲面實驗設計法(Response surface methodology, RSM)進行培養基最適化設計,研究證實Zymomonas mobilis轉化葡萄糖成乙醇之最適化培養基組成為:Glucose (166.5 g/L)、Yeast extract (6.1 g/L)、KH2PO4 (1 g/L)、(NH4)2HPO4 (1 g/L)、MgSO4•7H2O (0.5 g/L)。Zymomonas mobilis利用上述最適化培養基,可得最高之乙醇濃度、產率及理論轉化率,分別達 77.75 g/L、3.24 g/L/h與91.36 %。在重複批次發酵策略上,利用固定化的系統優於懸浮系統,固定化的載體以藻酸鈣為主,藻珠的體積為工作體積的10%,接菌量以工作體積的5%所顯示的效果最佳,其產率達到3.58g/L/h。在發酵液的回收與重覆使用的實驗上顯示了可以省下70.12%的水資源。利用減壓濃縮儀從發酵液當中萃取酒精的條件測試,以80mbar/45℃所顯示的效率最好,其中回收率為89.77%,萃取出的酒精濃度為38.36%,再利用減壓濃縮機處理數次之後也可得77.71%(V%)之酒精。由實驗結果顯示Zymomonas mobilis確係適合於乙醇工業化大量生產之菌株。未來冀望以此最適化培養基為基礎,進行不同發酵策略之探討,進而獲得較佳的乙醇產率。
Zymomonas mobilis is a gram-negative and facultative anaerobic bacterium. It uses the Entner-Doudoroff pathway to synthesize ethanol by catabolism of carbohydrates. While using glucose as the principle substrate, Z. mobilis offer the higher specific rates of sugar uptake and ethanol production. Thus Z. mobilis acts as a suitable candidate for industrial production of bioethanol. The aim of our study is to develop an optimal medium for Z. mobilis ATCC 29191 that could biotransfer glucose to ethanol. Interestingly after 40 hour fermentation when glucose (150g/L) and (NH4)2SO4 (1g/L) as the carbon and nitrogen sources the ethanol concentration, productivity, and theoretical yield is 64.70 g/L,1.61 g/L/h and 84.39 % respectively for 40h fermentation. The further research demonstrated that the (NH4)2SO4 (1g/L) was replaced by (NH4)2HPO4 (1g/L) not only promotes the ethanol productivity to 2.69 g/L/h but also maintain the high theoretical yield to 84.44%. Additionally, this research carries on the optimal culture medium using the response surface methodology. These results demonstrated that the optimal medium for Z. mobilis ATCC 29191 to produce ethanol were glucose (166.5g/L), yeast extract (6.1g/L), KH2PO4 (1g/L), (NH4)2HO4 (1g/L), MgSO4 (0.5g/L). Using optimal culture medium, the highest ethanol concentration, productivity, theoretical yield is 77.75g/L, 3.24g/L/h and 91.36%. The immobilization is better than suspension system in the repeat batch fermentation strategy. The immobilized carrier is calcium alginate beads, that volume of beads is 10% of working volume and the inoculated concentration is 5% of working volume. Using this condition to produce ethanol, the ethanol productivity could reach to 3.58g/L/h. There is no difference in ethanol production when Z. mobilis ferment with fresh medium or the recycling disused fermentation fluid, and further could save about used 70.12% water. The rotary evaporator can separate out 38.36%(v%) ethanol and recycling percentage 89.77% from the fermentation broth when the operation condition condition is set in 80mbar/45℃. It will gain the 77.71%(v%) ethanol after deal with repeatedly.
Our results, newly showed that Zymomonas mobilis is a suitable strain for the ethanol industrialization production. The future work, we hope to use this optimal culture medium to find out the great productivity of ethanol with different fermentation strategy.
目錄
摘 要 I
Abstract III
誌謝 V
目錄 VI
表目錄 IX
圖目錄 X
第一章 序論 1
1.1研究背景與動機 1
第二章 文獻回顧 5
2.1 Zymomonas mobilis與Yeast的比較 5
2.2 Zymomonas mobilis的發現 5
2.3 Zymomonas mobilis的型態與生長條件 6
2.4 Zymomonas mobilis的主要性質 6
2.5 Zymomonas mobilis相關研究 7
2.6 細胞固定化之意義與原理 9
2.7 細胞固定化之方法 9
第三章 實驗材料與方法 16
3.1 實驗藥品與儀器 16
3.1.1 實驗藥品 16
3.1.2 實驗儀器 17
3.1 菌株及培養基 17
3.1.1菌株 17
3.1.2 活化培養基成分 17
3.1.3 Zymomonas mobilis 主要培養基成份[25] 18
3.1.4 培養方式與條件 18
3.2分析方法 18
3.2.1 微生物生長之分析 18
3.2.2 DNS還原糖測定法 19
3.2.3 酒精之定量分析 19
3.3 實驗設計法-回應曲面法 20
3.3.1 二水準因數設計(Two-level Factorial Design) 20
3.3.2 陡升路徑法(Method of path steepest ascent) 21
3.3.3 中心混成設計(Central Composite Design) 21
3.4 細胞固定化方法發酵生產酒精之測試 22
第四章 結果與討論 26
4.1 培養基碳源和氮源的篩選 26
4.1.1碳源: 26
4.1.2複合氮源: 27
4.1.3無機氮鹽: 27
4.2微量元素之篩選 28
4.3以實驗設計法進行培養基中的成分組成之最佳化探討 29
4.3.1二水準因數設計(Two-level factorial design) 29
4.3.2陡升路徑法(Method of steepest ascent) 30
4.3.3 回應曲面法(Response Surface Methodology) 30
4.4 Zymomonas mobilis ATCC 29191之發酵策略之探討 31
4.4.1 以藻酸鈉做為固定化載體之重複批次發酵策略之探討 31
4.4.2 相同接菌量接入不同體積藻酸鈉之重複批次發酵策略探討 32
4.4.3 不同接菌量包埋入相同體積藻酸鈉之重複批次發酵策略探討 32
4.4.4 酒精的萃取 33
4.4.5固定化重複批次發酵與廢棄培養液的重覆使用 33
第五章 結論 64
參考文獻 66

表目錄
表2-1 Z. mobilis與Yeast的比較 11
表2-2 Z. mobilis的主要性質 12
表4-1 利用不同碳源來發酵生產酒精的轉化率 35
表4-2 在單一氮源存在下利用Zymomonas mobilis來發酵生產酒精之結果 35
表4-3 在培養基中缺少營養源MgSO4、KH2PO4發酵生產酒精對酒精產量影響的實驗設計與結果 36
表4-4 培養基當中的glucose、yeast extract、(NH4)2HPO4這三種成分濃度的+1(high level)以及-1(low level)的正規化水準表 36
表4-5 Two-level以Plackeet-Burman folded method 的實驗設計與結果 37
表4-6 two-level 實驗設計以Plackeet-Burman folded method 回歸分析表 38
表4-7 陡升路徑之實驗設計與結果 38
表4-8 回應曲面法以Central-Composite and Box-Behnken design之16組實驗來尋求兩個因子之最適化濃度與酒精的最高產量 39
表4-9 RSM實驗設計以Central-Composite and Box-Behnken design 之回歸分析表 40
表4-10 相同接菌量包埋入不同體積藻珠之酒精產率 40
表4-11利用RSM所得培養基利用5、10、20與30毫升之接菌量固定於10毫升藻珠體積之酒精產率 41
表4-12 利用減壓濃縮儀分離培養液與酒精所設定的實驗條件與所得之結果 41

圖目錄
圖1-1 生質能源的來源與應用 4
圖2-1 Entner-Doudoroff pathway in Zymomonas 13
圖2-2 Overview of metabolic pathway of Zymomonas 14
圖2-3 各種細胞固定化之簡易圖示 15
圖2-4 藻酸鈉結構。(G: L-glucuronic acid;D-mannuronic acid) 15
圖3-1 葡萄糖之DNS還原糖測定法檢量線 23
圖3-2 酒精之HPLC檢量線 23
圖3-3 回應曲面法實驗過程 24
圖3-4 細胞固定化之藻珠製備實驗簡易圖 25
圖4-1 不同碳源利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之生長曲線 42
圖4-2 不同碳源利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之酒精產量曲線 43
圖4-3 不同複合氮源利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之生長曲線 44
圖4-4 不同複合氮源利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之酒精產量曲線 45
圖4-5不同無機氮源利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之菌體生長曲線 46
圖4-6不同無機氮源利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之酒精產量曲線 47
圖4-7 利用Zymomonas mobilis 在單一氮源存在下發酵生產酒精之菌體生長曲線 48
圖4-8利用Zymomonas mobilis 在單一氮源存在下發酵生產酒精之酒精產量曲線 49
圖4-9 Zymomonas mobilisz在高濃度碳源培養基當中額外添加二價金屬鐵離子與鋅離子之酒精產量曲線 50
圖4-10 利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之培養基碳源glucose之high level、low level篩選 51
圖4-11利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之培養基複合氮源yeast extract之high level、low level篩選 52
圖4-12利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之培養基無機氮源(NH4)2HPO4之high level、low level篩選 53
圖4-13 利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之培養基營養源KH2PO4之high level、low level篩選 54
圖4-14 利用Zymomonas mobilis發酵生產酒精之培養基營養源MgSO4之high level、low level篩選 55
圖4-15 陡升路徑法由新步伐-1至新步伐+8所得之實驗結果 56
圖4-16 glucose與yeast extract對酒精產量之曲面圖 57
圖4-17 利用RSM所得之結果三重複之酒精產量與理論質之比較 58
圖4-18 利用RSM所得最佳化培養基比較懸浮系統與固定化系統之酒精產量 59
圖4-19 利用RSM所得最佳化培養基培養相同接菌量分別包埋入5、10、20、40毫升藻珠之葡萄糖殘餘量與酒精產量 60
圖4-20 利用RSM所得培養基利用5、10、20與30毫升之接菌量固定於10毫升藻珠體積之酒精產量 61
圖4-21 HPLC分析稀釋之純酒精(4-21a)與減壓濃縮儀分離出之酒精(4-21b) 62
圖4-22 重複使用廢棄培養液實驗之流程示意圖 62
圖4-23 比較重覆使用廢棄發酵液與置換新鮮培養液之細胞固定化重覆批次發酵之酒精產量 63
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