臺灣博碩士論文加值系統

造成痤瘡的主要致病菌是痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)；菌體會分泌脂解酵素(Lipase)，分解皮膚油脂產生脂肪酸，促進痤瘡發炎的形成。本研究之目的為探討不同來源之幾丁聚醣(Chitosan)對於抑制脂解酵素活性及抑制痤瘡丙酸桿菌生長之關連。第一部份以松杉靈芝(Ganoderma tsugae)之子實體經萃取後之廢渣、雙紡錘包子蟲草(Cordyceps bifusispora)之菌絲體、匍枝根黴菌(Rhizopus stolonifer)之菌絲體及蝦蟹殼等四種材料萃取所得之幾丁聚醣為材料 (簡稱如下表所示)，進行其對痤瘡丙酸桿菌抑菌能力之篩選。試驗結果顯示三種真菌來源之幾丁聚醣對痤瘡丙酸桿菌均有抑制效果，最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為16-32 μg/mL，其中以匍枝根黴菌之抑菌效果最佳(16 μg/mL)；蝦蟹殼來源之幾丁聚醣之最小抑菌濃度則為16 μg/mL。本研究之第二部份則探討上述四種不同來源之幾丁聚醣對於痤瘡丙酸桿菌分泌之脂解酵素活性抑制之效果。試驗結果顯示在脂解酵素活性90.75U/L下，抑制活性效果隨材料濃度越高越好，其中以CI抑制效果最佳(16 μg/m下仍有32.7%抑制效果)，SAC最差(64μg/m以下即無抑制效果)。本研究之第三部份為期望利用pET32a(+)質體轉殖痤瘡丙酸桿菌脂解酵素基因(gehA)，藉誘導基因表現在大腸桿菌BL21(DE3)中大量製備帶有thioredoxin之融合蛋白；結果顯示，轉殖之DNA經序列比對為正確排列，亦可表現分子量55kDa之融合蛋白，但表現蛋白大部份出現在不可溶的包含體(inclusion body)中；在嘗試取出可溶性蛋白或用強力介面活性劑取得不溶性蛋白，並經重新摺疊蛋白步驟均無法呈現脂解酵素之活性，本部份研究得做為未來研究之基礎。

Propionibacterium acnes (P. acnes) which played an important role in the pathogenesis of acne vulgaris. Extracellular lipases produced by P. acnes in vivo act as key enzyme in the hydrolyzation pathway of native sebum triacylglycerols to glycerol and free fatty acids (FFA) which can cause inflammation. The aim of this study is to investigate whether or not chitosan from different materials such as cell wall component from Ganoderma tsugae、Cordyceps bifusispora and Rhizopus stolonifer possessed the inhibitory potency on the growth of P. acnes and/or the activity of lipase. We first analysed the antimicrobial activity of chitosans from Ganoderma tsugae、Cordyceps bifusispora、Rhizopus stolonifer and crustacean. The result showed that chitosans from three different fungi materials all works(minimum inhibitory concentration, MIC value of 16~32 μg/ml).The chitosan from Rhizopus stolonifer, which showed markedly antimicrobial activity(MIC value of 16 μg/ml ).Chitosan showed an MIC value of 16 μg/ml toward crustacean. Moreover, analyzing the inhibitory of lipase activity of chitosans from different materials, we find all chitosans are work. Chitosan showed the markedly inhibitory of lipase activity value of 16 μg/ml toward crustacean (inhibitory rate about 32.7%). Furthermore, lipase gene (GehA) was constructed in the plasmid vector pET32a(+).The resultant plasmids were transformed into E. coli BL21(DE3) and over express of thioredoxin fusion lipase. The nucleotide sequence of fusion lipase is confirmed and a predicted molecular mass of 55kDa, but lipase was present in the in soluble fraction in the form of inclusion bodies. We tried express lipase in a soluble from or used detergent to purify protein and refold protein by several steps, but still not work. This part of study can be a foundation for further investigation.

中文摘要…………………………………………………………………….…………I
Abstract……………………….…………………………………………...................III
誌謝…………………………………………………………………….......................V
總目錄…………………………………………………………….……………...…VII
表目錄…………………………………………………..…………….........................X
圖目錄…………………………………………..……………………………………XI

第一章 緒論……………………………………………………………..……………1
一、幾丁質與幾丁聚醣的由來…………………………………..................1
二、幾丁質與幾丁聚醣之構造……………………………………………..2
三、幾丁聚醣的物理、化學性質……………………………………………3
四、本實驗室所開發的生物性材料………………………………………..5
第二章 皮膚與痤瘡…………………………………………………………………..6
一、皮膚的簡介…………………………………………………………......6
二、痤瘡的形成……………………………………………………………..7
三、痤瘡在臨床上的治療…………………………………………………10
第三章 痤瘡丙酸桿菌與脂解酵素…………..……………………………………..13
一、皮膚常見微生物………………………………………………………13
二、痤瘡丙酸桿菌的特徵…………………………………………………14
三、脂肪酵素之簡介………………………………………………………15
第四章 研究動機與目的……………………………………………………………17
第五章 實驗架構……………………………………………………………………19
 
第六章 實驗材料與方法……………………………………………………………20
第一節 實驗材料 (Materials)…………………………………………………20
一、幾丁質與幾丁聚醣……………..……………………………………..20
二、基因表現蛋白材料………………………………..…………………..20
三、化學實驗試劑…………………………………………………..……..21
四、實驗設備………………………………………………………...…….23
第二節 實驗方法(Methods)………………………………………..………….24
第一部分、不同真菌材料幾丁聚醣的製備…………………………………24
一、各種幾丁質來源……………………………………………………....24
二、各種幾丁質製備………………………………………………………25
三、各種幾丁聚醣製備……………………………………………………26
第二部分、各種真菌幾丁聚醣之基本化學特性測定……………………....26
一、酸水解……………..…………………………………………………..26
二、Elson-Morgan assay……………………….…………………………..27
三、Dintrosalicylic acid assay (DNS)……………………………………...27
第三部分、CI與真菌幾丁聚醣對痤瘡丙酸桿菌的抑菌效果…..………….28
一、痤瘡桿菌開管與菌種活化方法………………………………………28
二、痤瘡桿菌培養條件……………………………………………………29
三、最小抑菌濃度測試minimum inhibitory concentration test……..……29
第四部份、CI與真菌幾丁聚醣對痤瘡丙酸桿菌分泌脂酶之抑制效果.......30
一、痤瘡丙酸桿菌分泌脂酶之製備 ………….………………………….30
二、測量Lipase activity……………………………………………………30
第五部分、分生技術大量表現痤瘡丙酸桿菌脂酶….……………..……….32
一、構築質體表現基因蛋白 ……………………………………………..32
二、蛋白質的誘導、表現與純化………………………..…………………32
三、InVision™ His-tag Stain for his-tag fusion protein…………………...34
四、確定表現蛋白之可溶性………………………………………………34
五、取出位於periplasmic部位之可溶性蛋白……………………………35
六、失活蛋白質refolding法………………………………..……………..35
第七章 實驗結果與討論………………………………………………………..…..37
一、幾丁聚醣材料製備之探討………………..…………………………..37
二、各種真菌幾丁聚醣之基本化學特性探討……………………………38
三、痤瘡丙酸桿菌分泌脂酶製備之探討…………………………………38
四、CI與真菌幾丁聚醣對痤瘡丙酸桿菌抑菌效果之探討……………...39
五、CI與真菌幾丁聚醣對痤瘡丙酸桿菌分泌脂酶抑制效果之探討…...39
六、分生技術大量表現痤瘡丙酸桿菌脂酶之探…………………………40
七、表現蛋白質活性討論…………………………………………………43
第八章 結論………………………………………………………………………....45
參考文獻……………………………………………………………………..………46
論文圖表集…………………………………………………………………………..49
附錄一…………………………………………………………..……………………60
附錄二…………………………………………………..……………………………68

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