臺灣博碩士論文加值系統

黑色素生成作用對於人類皮膚以及毛髮顏色來說是合成色素的重要反應。在人體皮膚上黑色素除了形成顏色之外也是抵擋紫外光及結合自由基的重要物質，酪胺酸酶 (Tyrosinase) 為含有二價銅離子的關鍵黑色素生成酵素。清酒酒粕(Sake lees) 為製造清酒的副產物，內含許多的營養成分。根據文獻指出，清酒酒粕對於製酒者的皮膚具有保濕及美白的功能。
在這篇研究中，利用Lactobacillus GG這株標準菌作為對照組以及四株由本實驗室從本土醱酵產品所篩選出來的植物性乳酸菌藉由添加不同濃度的清酒酒粕 (0 %, 10 %, 20 %, 30 % and 40 %) 去醱酵培養，取已過濾的醱酵上清液去測試對於mushroom tyrosinase活性的抑制效果以及減少小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell line) 黑色素的生成影響。結果顯示，經由Lb. casei E7及E15這兩株乳酸菌與酒粕所醱酵的上清液分別具有60 %及40 %抑制mushroom tyrosinase的活性；也能分別具有42 %及26 %抑制黑色素生成的效果。將具有抑制成分的上清液經由HPLC以及Micro FT/IR這兩台儀器去確認成分後，結果顯示，抑制成分可能是亞麻油酸 (Linoleic acid)。
根據這篇研究指出植物性乳酸菌藉由添加清酒酒粕醱酵培養後能產生具有美白效果的亞麻油酸，而乳酸為乳酸菌醱酵作用的主要產物，也是人體皮膚中天然保濕因子 (NMF) 的成分之一，因此，具有能發展成為美白化妝品的潛力。

The melanin-synthesizing is an important role of pigmentation on human skin and hair color expression. It is also an important defense of human skin against UV-induced injury and to scavenge oxidative free radicals. Tyrosinase is a copper-containing enzyme involved in melanin synthesis. Sake lees, byproduct in the production of sake, are rich in nutrition. It is reported that the sake lees are good for sake brewers to keep their skin moisture and whitening.
In this study, Lactobacillus GG and the four lactobacillus strains isolated from local Taiwanese fermented vegetables were used to fermented with different concentrations of sake lees extract (0 %, 10 %, 20 %, 30 % and 40 %), and the supernatant filtrates were used to test mushroom tyrosinase inhibition activity and decrease melanin production of B16-F0 cell line. According to the results, two supernatant filtrates from Lb. casei E7 and E15, could obviously inhibit the mushroom tyrosinase activity of 60 % and 40 %, and decrease melanin contents of B16-F0 cell line of 42 % and 26 %, respectively. The tyrosinase inhibitory compounds contained in supernatant filtrates were subjected to HPLC and Micro FT/IR to identify the compounds as linoleic acid.
Furthermore, lactic acid, the major product of lactic acid bacteria fermentation, which is a main component of human natural moisturizing factor (NMF). Therefore, the fermentation products from sake lees by the two lactobacilli will be very useful for application in the cosmetic field.

目錄
致謝 i
中文摘要 ii
英文摘要 iii
目錄 v
圖目錄 x
章節
第一章 緒論 1
1.1. 研究動機 1
1.2. 文獻探討 2
1.2.1. 皮膚的構造 2
1.2.1.1. 表皮 3
1.2.1.2. 真皮 9
1.2.1.3. 皮下組織 12
1.2.2. 黑色素 13
1.2.2.1. 黑色素種類 13
1.2.2.2. 黑色素細胞的分佈 14
1.2.2.3. 黑色素生成機制 15
1.2.2.4. 黑色素在黑色素細胞內的生成移轉 16
1.2.2.5. 黑色素功用 17
1.2.3. 酪胺酸酶 18
1.2.3.1. 酪胺酸酶簡介 18
1.2.3.2. 酪胺酸酶活性鍵結位置 19
1.2.3.2.1. 降低酪胺酸酶的活性 19
1.2.3.3. 影響酪胺酸酶活性因子 19
1.2.3.3.1. 內分泌影響 19
1.2.3.3.2. 物理化學因素影響 20
1.2.4. 清酒 22
1.2.4.1. 清酒簡介 22
1.2.4.2. 清酒釀造原料 22
1.2.4.2.1. 米 22
1.2.4.2.2. 水 22
1.2.4.2.3. 麴 23
1.2.4.2.4. 酵母菌 23
1.2.4.3. 清酒酒粕 24
1.2.5. 酵素動力學 24
1.2.5.1. 酵素簡介 24
1.2.5.2. 酵素抑制反應型態 25
1.2.5.2.1. 不可逆性抑制作用 26
1.2.5.2.2. 可逆性抑制作用 26
1.2.6. 乳酸菌 29
1.2.6.1. 乳酸菌簡介 29
1.2.6.2. 篩選乳酸菌 30
1.2.7. 實驗架構 31
第二章 材料與方法 32
2.1. 實驗材料 32
2.1.1. 藥品與酵素 32
2.1.2. 實驗儀器 33
2.1.3. 實驗耗材 34
2.1.4. 實驗菌株 35
2.1.5. 實驗細胞株 36
2.2. 實驗方法 36
2.2.1. 乳酸菌醱酵酒粕最適條件測試 36
2.2.1.1. 試藥配製 36
2.2.1.2. 實驗步驟I：(乳酸菌培養) 37
2.2.1.3. 實驗步驟II：(添加酒粕再經乳酸菌醱酵培養最適條件測試) 37
2.2.1.4. 實驗步驟III：(醱酵液內酒精含量與乳酸菌存活率之測試) 38
2.2.2. 體外抑制酪胺酸酶活性的測定 38
2.2.2.1. 試藥配製 38
2.2.2.2. 實驗步驟 39
2.2.3. 體外抑制酪胺酸酶活性的酵素動力學測定 39
2.2.3.1. 試藥配製 39
2.2.3.2. 實驗步驟 40
2.2.4.利用醱酵液處理測定黑色素細胞中的黑色素含量以及細胞存活率 40
2.2.4.1. 試藥配製 40
2.2.4.2. 實驗步驟I：(黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 培養) 42
2.2.4.3. 實驗步驟II：(黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 最適實驗條件測試) 43
2.2.4.4. 實驗步驟III：(黑色素 (Melanin) 標準曲線) 43
2.2.4.5. 實驗步驟IV：(黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 黑色素含量測試) 44
2.2.4.6. 實驗步驟V：(黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 細胞存活率測試) 45
2.2.5. 利用HPLC確認醱酵液內的有效抑制成分 45
2.2.5.1. 試藥配製 45
2.2.5.2. 實驗步驟 46
2.2.6. 利用Micro FT/IR確認醱酵液內的有效抑制成分 46
2.2.6.1. 試藥配製 46
2.2.6.2. 實驗步驟 46
第三章 結果 47
3.1. 篩選出能抑制mushroom tyrosinase活性的菌株醱酵液 47
3.2. 黑色素含量標準曲線 52
3.3. 利用醱酵液去測試對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 的影響 54
3.4. 醱酵液抑制機制的酵素動力學 64
3.5. 醱酵液對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 生長過程中黑色素生成的影響 68
3.6. 利用HPLC確認醱酵液內的有效抑制成分 70
3.7. 利用Micro FT/IR 確認醱酵液內的有效抑制成分的官能基 76
第四章 討論 78
參考文獻 83








圖目錄
圖1.2.1. 皮膚可分為3大部分：表皮 (Epidermis)、真皮 (Dermis) 以及皮下組織 (Hypodermis) 2
圖1.2.2. 表皮 (Epidermis) 由外而內分別為角質層 (Stratum comeum)、透明層(Stratum lucidum)、顆粒層 (Stratum granulosum)、棘細胞層 (Stratum spinosum)、基底層 (Stratum basale) 3
圖1.2.3. 表皮 (Epidermis) 中的黑色素細胞 (Melanocyte) 4
圖1.2.4. 表皮 (Epidermis) 中的角質層 (Stratum corneum) 5
圖1.2.5. 表皮 (Epidermis) 中的角質層 (Stratum corneum) 5
圖1.2.6. 表皮 (Epidermis) 中的透明層 (Stratum lucidum) 6
圖1.2.7. 表皮 (Epidermis) 中的顆粒層 (Stratum granulosum) 7
圖1.2.8. 表皮 (Epidermis) 中的棘細胞層 (Stratum spinosum) 8
圖1.2.9. 表皮 (Epidermis) 中的基底層 (Stratum germinativum) 9
圖1.2.10. 真皮 (Dermis) 中的汗腺 (Sweat Gland)、毛囊 (Hair Follicles) 以及血管 (Blood Vessels) 10
圖1.2.11. 真皮 (Dermis) 中的乳突層 (Papillary layer)、網狀層 (Reticular layer)11
圖1.2.12. 皮下組織 (Hypodermis) 12
圖1.2.13. 黑色素 (Melanin) 的結構 14
圖1.2.14. 黑色素生合成反應 (Melanogensis) 16
圖1.2.15. 酪胺酸酶 (Tyrosinase) 的結構 18
圖1.2.16. 酵素與基質結合後產生產物 25
圖1.2.17. 可逆性抑制作用的競爭型抑制 (Competitive Inhibition) 26
圖1.2.18. 可逆性抑制作用的非競爭型抑制 (Noncompetitive Inhibition) 27
圖1.2.19. 可逆性抑制作用的不競爭型抑制 (Uncompetitive Inhibition) 28
圖3.1. 篩選出能抑制mushroom tyrosinase活性的菌株醱酵液 49
圖3.1.1. 能抑制mushroom tyrosinase活性的酒粕醱酵液之比較 50
圖3.1.2. Lb. casei E7及E15的酒粕醱酵液內酒精含量之比較 51
圖3.2. 黑色素 (Melanin) 含量標準曲線 53
圖3.3.1. 篩選出最適實驗條件的黑色素細胞數 56
圖3.3.2. 小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 細胞數標準曲線 57
圖3.3.3. 小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 生長曲線 58
圖3.3.4. 酒粕醱酵液對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 生長及黑色素生成之影響 59
圖3.3.5. 酒粕醱酵液對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 黑色素生成影響之比較 60
圖3.3.6. 酒粕醱酵液對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 生長影響之比較 61
圖3.3.7. 酒粕醱酵液對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 生長及其黑色素生成影響之比較 63
圖3.4.1. 麴酸 (Kojic Acid) 抑制 mushroom tyrosinase 的酵素動力圖 65
圖3.4.2. Lb. casei E7與不同濃度酒粕 (0 %、10 %以及20 %) 醱酵培養的醱酵液抑制 mushroom tyrosinase 的酵素動力圖 66
圖3.4.3. Lb. casei E15 與不同濃度酒粕 (0 %、10 %以及20 %) 醱酵培養的醱酵液抑制 mushroom tyrosinase 的酵素動力圖 67
圖3.5. 酒粕醱酵液對於小鼠黑色素瘤細胞 (B16-F0 cell) 生長過程中黑色素生成的影響 70
圖3.6.1. Linoleic Acid 的HPLC液相層析圖 72
圖3.6.2. MRS broth的HPLC液相層析圖 73
圖3.6.3. MRS broth加上20 %酒粕的醱酵液的HPLC液相層析圖 74
圖3.6.4. 乳酸菌Lb. casei E15加上20 %酒粕的醱酵液的HPLC液相層析圖 75
圖3.6.5. 乳酸菌Lb. casei E7加上20 %酒粕的醱酵液的HPLC液相層析圖 76
圖3.7. 利用Micro FT/IR 確認醱酵液內的有效抑制成分的官能基 78

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