臺灣博碩士論文加值系統

　　本研究旨在探討於除水之有機溶劑中以脂肪分解酵素催化外消旋Naproxenyl 1,2,4-triazolide與醇類進行轉酯化動力分割。在不同來源脂肪分解酵素Bromelian、Lipase MY、Lipase PS、Lipase PS-D、Novo 435、Papain、及pCPL催化的轉酯化分割中，以Novo 435具備最佳的反應性與鏡像選擇性。故選擇Novo 435為目標酵素，再以不同極性的有機溶劑進行反應，其中MTBE較ISO、IPE、TBA有最佳的反應性與選擇性。而為了兼顧反應性及選擇性，選擇於45oC下進行反應。接著再改變不同鏈長之直鏈醇進行反應，發現不同直鏈醇對反應初速率及選擇性的影響不大，推測酵素催化的反應速率決定步驟在於醯化(acylation)反應。故本反應最佳的條件為45oC下除水MTBE中，以Novo 435催化外消旋Naproxenyl 1,2,4-triazolide與甲醇的轉酯化動力分割，再進一步以此反應條件進行熱力學分析及利用乒乓反應機構進行動力學分析。並以研究所得之最佳反應條件應用於其他azolides進行分割。

　　The purpose of this research is aimed to develop an enzymatically kinetic resolution process in anhydrous organic solvents with (R, S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide as the substrate. Different lipases such as Bromelian、Lipase MY、Lipase PS、Lipase PS-D、Novo 435、Papain and pCPL were firstly screened to enantioselectively transesterify the substrate where Novo 435 was selected as the best enzyme. Reaction in different anhydrous organic solvents and temperature were employed for studying the effects of solvents and temperature on the Novo 435 activity and enantioselectivity, where 45oC and anhydrous MTBE are beneficial for giving better lipase activity and enantioselectivity. A change of the alcohol acyl acceptor indicated that different straight-chain alcohols had minor effects on enzyme activity and enantioselectivity, implying that the acylation step was the rate-determining step. The thermodynamic analysis and kinetic analysis using a ping-pong bi-bi reaction mechanism were also performed at the optimum condition. Finally, the optimum reaction condition was applied to the other azolides.

目　錄
指導教授推薦書 i
口試委員會審定書 ii
長庚大學博碩士論文著作授權書 iii
致謝 iv
摘　要 v
Abstract vi
目　錄 vii
圖目錄 xi
表目錄 xiv
符號說明 xv
第一章　緒論
1-1 對掌性異構物 1
1-1-1 介紹 1
1-1-2 對掌性異構物的生理活性與重要性 2
1-2 非類固醇抗發炎藥物 4
1-2-1 介紹 4
1-2-2 (R, S)-Naproxen 5
1-3 Azolides 6
1-4 酵素 7
1-4-1 介紹 7
1-4-2 脂肪分解酵素 8
1-4-3 Candida antarctica lipase-B (CALB) 10
1-4-4 脂肪酵素於有機溶劑中的催化反應 11
1-5 酵素鏡像選擇性的提升 14
1-6 研究動機 15
第二章　原理
2-1 酵素動力分割 17
2-2 酵素催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide之轉酯動力分析 18
2-3 酵素分割之熱力學分析 20
第三章 實驗方法
3-1 藥品與材料 23
3-2 儀器設備 25
3-3 分析條件與方法 25
3-3-1 (R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide分析條件 26
3-3-2 (R,S)-Naproxen甲酯分析條件 26
3-3-3 (R,S)-Naproxen imidazolide分析條件 26
3-3-4 (R,S)-Naproxen pyrazolide分析條件 27
3-3-5 (R,S)-Naproxen 4-bromopyrazolide分析條件 27
3-3-6 (R,S)-Naproxen 三氟乙酯分析條件 27
3-4 實驗步驟 31
3-4-1 合成(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide 31
3-4-2 合成(R,S)-Naproxenyl imidazolide 31
3-4-3合成(R,S)-Naproxenyl pyrazolide 31
3-4-4合成(R,S)-Naproxenyl 4-bromopyrazolide 32
3-4-5 合成(R,S)- Naproxenyl 三氟乙酯 32
3-4-6 不同酵素對(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割的影響 33
3-4-7 不同反應溶劑對(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割的影響 33
3-4-8 不同溫度對(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割的影響 34
3-4-9 不同醇類對(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割的影響 34
3-4-10 固定醇濃度以進行(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide酵素動力參數擬合 34
3-4-11 固定醯胺濃度進行(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide酵素動力參數擬合 35
3-4-12 酵素再使用性 35
3-4-13 串聯基質合成與酵素分割 36
3-4-14 不同(R,S)-Naproxenyl azolides轉酯化分割的影響 36
第四章　結果與討論
4-1 (R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide合成 37
4-2 條件篩選 39
4-2-1 酵素篩選 39
4-2-2 溶劑篩選 42
4-2-3 溫度篩選 44
4-2-4 醇類篩選 46
4-3 熱力學分析結果 47
4-4 酵素催化轉酯化動力分割參數偶合 49
4-5 酵素再使用性 60
4-6串聯基質合成與酵素分割 61
4-7 不同azolides的比較 62
第五章　結論 63
第六章　未來工作 65
參考文獻 66

圖目錄
圖1-1 對掌異構物示意圖 1
圖1-2 非類固醇抗發炎藥物的化學結構分類[4] 4
圖1-3 (R,S)-Naproxen結構式 5
圖1-4 液晶起始合成步驟[6] 5
圖1-5 常見的azolides 6
圖1-6 脂肪分解酵素和酯解酵素催化動力之差異[17] 9
圖1-7 CALB遵循乒乓反應機構催化反應進行[19] 9
圖2-1 絲胺酸水解酵素之乒乓反應機構[5] 17
圖2-2 (R,S)-Naproxen 1,2,4-triazolide之動力分割 18
圖2-3 酵素動力分割反應之簡化示意圖 19
圖2-4 酵素催化動力分割之反應動力與Gibbs 自由能示意圖[34] 22
圖3-1 (a) 為(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide之HPLC分析結果；(b) 以MTBE中1 mM的2-硝基甲苯為內標物之(R)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide檢量線。 28
圖3-2 (a) 為(R,S)-Naproxen甲酯之HPLC分析結果；(b) 以MTBE中1 mM的2-硝基甲苯為內標物之(R)-Naproxen甲酯檢量線。 29
圖3-3 (R,S)-Naproxenyl imidazolide之HPLC分析結果。 30
圖3-4 (R,S)-Naproxenyl pyrazolide之HPLC分析結果。 30
圖3-5 (R,S)-Naproxenyl 4-bromopyrazolide之HPLC分析結果。 30
圖3-6 (R,S)-Naproxenyl 三氟乙酯之HPLC分析結果。 30
圖4-1 (R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide之H1-NMR圖譜。 38
圖4-2 於45oC下除水異辛烷中，利用不同酵素催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯反應之轉化率對時間作圖。(a) Bromelain；(b) Lipase MY；(c) Lipase PS；(d) Lipase PS-D；(e) Novo 435；(f) Papain；(g) pCPL。(●) XS；(○) XR。 41
圖4-3 於45oC下不同除水溶劑中，利用Novo 435催化(R,S)- Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割之轉化率對時間作圖。(a) ISO；(b) IPE；(c) MTBE；(d) TBA。(●) XS；(○) XR。 43
圖4-4 於不同溫度下除水MTBE中，利用Novo 435催化(R,S)- Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割之轉化率對時間作圖。(a) 35oC；(b) 45oC；(c) 55oC。(●) XS；(○) XR。 45
圖4-5 不同溫度反應初速率與鏡像選擇性比值之對數對絕對溫度倒數圖。(○) ln [VR [Et]-1]；(●) ln [VS [Et]-1]；(▼) ln (VR VS-1)。 48
圖4-6 於45oC除水MTBE中，固定醇濃度，改變不同(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide與(S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide濃度，以Novo 435催化轉酯化反應之動力分割平面圖。(a) (R)型基質；(b) (S)型基質；(○) 30 mM甲醇；(▽, ▼) 50mM甲醇；(□, ■) 100 mM甲醇。 (—)最佳偶合曲線。 51
圖4-7 於45oC除水MTBE中，改變醇濃度，以Novo 435催化3 mM (R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide進行轉酯化反應之動力分割平面圖。(a) (R)型基質；(b) (S)型基質。(—)最佳偶合曲線。 52
圖4-8 於45oC除水MTBE中，以Novo 435催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide進行轉酯化反應之動力分割立體圖。 (a) (R)型基質；(b) (S)型基質。(—)最佳偶合曲線。 53
圖4-9 於45oC除水MTBE，固定甲醇濃度30 mM，以Novo 435催化不同濃度(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割，(R)型(○)與(S)型(●)轉化率隨時間變化圖。(a) 3.17 mM；(b) 15.12 mM；(c) 35.96 mM；(d) 55.87 mM；(e) 67.86 mM。(—)最佳偶合曲線。 55
圖4-10 於45oC除水MTBE，固定甲醇濃度50 mM，以Novo 435催化不同濃度(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割，(R)型(○)與(S)型(●)轉化率隨時間變化圖。(a) 2.90 mM；(b) 10.63 mM；(c) 17.21 mM；(d) 34.59 mM；(e) 65.55 mM。(—)最佳偶合曲線。 56
圖4-11 於45oC除水MTBE，固定甲醇濃度100 mM，以Novo 435催化不同濃度(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割，(R)型(○)與(S)型(●)轉化率隨時間變化圖。(a) 9.17 mM；(b) 12.12 mM；(c) 30.35 mM；(d) 46.49 mM；(e) 65.96 mM。(—)最佳偶合曲線。 57
圖4-12 於45oC除水MTBE，固定甲醇濃度50 mM，以Novo 435催化不同濃度(S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割，(R)型(○)與(S)型(●)轉化率隨時間變化圖。(a) 6.12 mM；(b) 9.73 mM；(c) 17.62 mM；(d) 25.75 mM；(e) 31.74 mM。(—)最佳偶合曲線。 58
圖4-13 於45oC除水MTBE，固定甲醇濃度100 mM，以Novo 435催化不同濃度(S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割，(S)型(●)轉化率隨時間變化圖。(a) 5.35 mM；(b) 12.61 mM；(c) 18.74 mM；(d) 24.08 mM；(e) 30.45 mM。(—)最佳偶合曲線。 59
圖4-14 於45oC除水MTBE中，以Novo 435催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide進行轉酯化分割之酵素再使用性。 60

表目錄
表1-1 單一鏡像異構物之製造途徑[3] 3
表1-2 一般常用有機溶劑之log P值[28] 13
表4-1 於45oC下除水異辛烷中，不同脂肪分解酵素催化(R,S)-　Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯反應之反應性與選擇性。外消旋基質濃度1 mM、醇濃度100 mM、酵素量6 mg mL-1。 40
表4-2 於45oC下除水的不同溶劑中，以Novo 435催化(R,S)- Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割反應性與選擇性。外消旋基質濃度3 mM (ISO因考慮到溶解度，以1 mM進行反應)、甲醇濃度100 mM、酵素量6 mg mL-1。 42
表4-3 於不同溫度除水MTBE中，以Novo 435催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割之反應性與選擇性。外消旋基質濃度3 mM、甲醇濃度100 mM、酵素量6 mg mL-1。 44
表4-4 於45oC下除水MTBE中，添加不同醇類以Novo 435催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割反應性與選擇性。外消旋基質濃度3 mM、醇濃度100 mM、酵素量6 mg mL-1。 46
表4-5 於45oC 下Novo 435對(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割之熱力學參數。 47
表4-6 Novo 435催化(R,S)-Naproxenyl 1,2,4-triazolide轉酯化分割之動力參數及參數組合 54
表4-7於45oC下除水MTBE中，改變離去基，以Novo 435催化(R,S)-Naproxenyl azolides轉酯化分割之反應性與選擇性。外消旋基質濃度3 mM、甲醇100 mM、酵素量6 mg mL-1。 62

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