臺灣博碩士論文加值系統

遺傳疾病通常是因為基因缺陷造成的問題，所以基因治療在遺傳疾病方面扮演了重要的角色。進行基因治療時基因轉殖的方式有很多，陽離子脂質體即為一種很穩定且常用的方式，其中包括了乳液、微脂體、固態脂質奈米乳液等形式。我們最主要的目標即為發展一種帶有正電荷奈米乳液的系統，希望能與DNA做接合並成為基因轉殖的載體。
本研究中在陽離子奈米乳液的製備時是使用陽離子界面活性劑及以交聯劑交聯胺基酸的方式，用超音波均質的方式使其達到奈米級的狀態。一個理想的基因傳輸載體不僅要有轉染效率同時也要做細胞毒性試驗，以期能夠確認即使能夠與DNA做接合後，也不會有安全上的問題，這樣一來才能夠正確的來當作基因轉殖的系統。將製備好的帶正電奈米乳液與質體接合後，在纖維組織母細胞(3T3-Swiss albino)中進行轉染實驗。實驗結果發現加入陽離子界面活性劑的奈米乳液及利用EDC交聯胺基酸製備的正電荷奈米乳液皆有轉染成功的現象。以陽離子界面活性劑製備之奈米乳液轉染效可高達57.97%；利用EDC交聯胺基酸製備的奈米乳液則可達27.64%。
由此結果顯示，以此製備之正電型奈米乳液為非病毒型載體開創另一新方式。

Gene transfer represents an important advance in the treatment of both genetic and acquired diseases. Many cationic lipid carriers including liposome, emulsion, and solid lipid nanoparticles have been used for gene transfer. Our aims were to develop the cationic nanoemulsions which can bind DNA and can be used as gene delivery carriers. The nanoemulsion was prepared by the ultrasonication technique. The cationic nanoemulsions included cationic surfactant, cetethyl morpholinium ethosulfate, or conjugated amino acid. An ideal vectoer not only had good transfection efficiency but also shown safe results. These nanoemulsions of cytotoxicity was low as shown in our cytotoxic data.
In our experiment the cationic nanoemulsion was used to deliver plasmid DNA to the cell line, 3T3-Swiss albino . Our results indicated that the cationic nanoemulsions containing cationic surfactant (Ketramine) and Lysine-based have transfection efficiency 55.97% and 27.64%, respectively we successfully developed cationic non-viral vectors which are potent DNA carriers for gene transfer system.

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長庚大學博（碩）士學位論文口試委員會審定書長庚大學博碩士論文著作授權書
長庚大學博碩士論文著作授權書 iii
致謝 iv
摘　要 v
Abstract vi
目　錄 vii
圖目錄 xi
表目錄 xv
第一章、研究動機與目的 1
第二章、文獻回顧 2
2.1基因治療及載體 2
2.2病毒型載體 3
2.2.1反轉錄病毒 3
2.2.2腺病毒載體 3
2.2.3腺相關病毒 3
2.3非病毒型載體 4
2.3.1物理性之基因轉殖 4
2.3.2電擊方式之基因轉殖 5
2.3.3化學性之基因轉殖 5
2.4以乳液為系統之基因傳遞 6
2.5正電脂質系統的細胞轉染機制 7
2.6奈米乳液系統 9
2.6.1奈米乳液介紹 9
2.6.2奈米乳液的形成 10
2.6.3界面活性劑 11
2.7 EDC交聯 15
2.7.1正電型胺基酸 15
2.7.2 EDC交聯之方式 16
2.8 Malvern Zetasizer Nano 18
2.8.1奈米乳液粒徑大小及粒徑分佈指數 18
2.8.2奈米乳液表面電位 19
2.9 流式細胞儀 20
2.10 細胞存活率測定 21
2.11穿透式電子顯微鏡 22
第三章、材料與儀器設備 23
3.1材料 23
3.2儀器設備 24
3.3細胞株 25
3.3.1 纖維組織母細胞 (3T3) 25
3.3.2 細胞繼代培養 25
第四章、實驗方法 26
4.1帶正電奈米乳液配方組成與製備 28
4.1.1奈米乳液配方製備組成 28
4.1.2利用陽離子界面活性劑製成奈米乳液 28
4.1.3以胺基酸修飾之奈米乳液配方製備組成 28
4.1.4利用EDC交聯使奈米乳液帶正電 28
4.2奈米乳液粒徑大小、分佈指數及表面電位的測定 29
4.2.1奈米乳液粒徑大小及分佈指數測定 29
4.2.2奈米乳液表面電位測定 29
4.3萃取質體DNA 29
4.4帶正電奈米乳液與DNA接合方式 30
4.5細胞轉染實驗 30
4.6轉染效率之測定 31
4.5細胞存活率測定 32
4.6以穿透式顯微鏡(TEM)觀察複合體之情形 33
第五章、結果與討論 34
第一部分：以陽離子界面活性劑製備奈米乳液 34
5.1篩選陽離子界面活性劑 34
5.2含1%陽離子界面活性劑之奈米乳液其轉染效率 37
5.2.1不同cationic surfactant/DNA (w/w) 比例對轉染效率之影響 37
5.2.2不同粒徑大小對轉染效率之影響 43
5.2.3以正電荷界面活性劑製備奈米乳液之穩定性 49
5.2.4以TEM觀察複合體之情形 50
5.3含5%陽離子界面活性劑之奈米乳液其轉染效率 51
5.3.1篩選含5%陽離子界面活性劑之奈米乳液載體 51
5.3.2不同Ketramine含量對轉染效率之影響 53
5.3.3不同cationic surfactant/DNA (w/w)比例對轉染效率之影響 55
5.3.4不同粒徑大小對轉染效率之影響 57
5.3.5以TEM觀察複合體之情形 59
第二部分：以胺基酸交聯的方式製備奈米乳液 60
5.4選擇交聯劑EDC的濃度 60
5.4選擇Amino acid/NE (w/w) 的比例 64
5.5胺基酸修飾之奈米乳液進行細胞轉染及存活率 68
5.5.1三種胺基酸修飾之奈米乳液其轉染效率 68
5.5.2不同Amino acid/DNA (w/w) 比例對轉染效率之影響 70
5.5.3不同粒徑大小對轉染效率之影響 74
5.5.4以胺基酸修飾正電荷奈米乳液之穩定性 79
5.5.5以TEM觀察複合體之情形 80
5.6與市售轉染試劑比較 81
第六章、結論 82
參考文獻 84
附錄 88
圖1、奈米粒子與RNA交互作用之情形 7
圖2、細胞轉染的作用機制 8
圖3、O/W之奈米乳液示意圖 10
圖4、超音波均質實驗裝置 11
圖5、Ketramine之化學結構 12
圖6、Forestall之化學結構 13
圖7、Octadecylamine之化學結構 13
圖8、CTAB之化學結構 14
圖9、DDAB之化學結構 14
圖10、三種正電荷胺基酸之化學結構圖 15
圖11、EDC一步驟交聯示意圖 17
圖12、EDC二步驟交聯示意圖 17
圖13、穿透式電子顯微鏡構造 22
圖14、質體DNA基因圖譜 29
圖15、流式細胞儀圖示 31
圖16、添加五種不同陽離子界面活性劑之奈米乳液其轉染效率 36
圖17、添加五種不同陽離子界面活性劑之奈米乳液其存活率 36
圖18、不同Ketramine/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 38
圖19、不同Ketramine/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 38
圖20、不同Forestall/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 39
圖21、不同Forestall/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 39
圖22、不同Octadecylamine/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 40
圖23、不同Octadecylamine/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 40
圖24、不同CTAB/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 41
圖25、不同CTAB/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 41
圖26、不同DDAB/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 42
圖27、不同DDAB/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 42
圖28、含Ketramine之不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 46
圖29、含Forestall之不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 46
圖30、含Octadecylamine之不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 47
圖31、含CTAB之不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 47
圖32、含DDAB之不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 48
圖33、以1%陽離子界面活性劑製備奈米乳液載體之穩定性 49
圖34、以添加1%CTAB之奈米乳液與DNA連接的情形 50
圖35、添加5%不同陽離子界面活性劑之奈米乳液其轉染效率 52
圖36、添加5%不同陽離子界面活性劑之奈米乳液其存活率 52
圖37、不同Ketramine含量之轉染效率 54
圖38、不同Ketramine含量之細胞存活率 54
圖39、不同5% Ketramine/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 56
圖40、不同5% Ketramine /DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 56
圖41、添加5% Ketramine不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 58
圖42、以添加5% Ketramine之奈米乳液與DNA連接的情形 59
圖43、EDC濃度對以Arginine修飾之奈米乳液其粒徑大小及表面電位之影響 61
圖44、EDC濃度對以Lysine修飾之奈米乳液其粒徑大小及表面電位之影響 62
圖45、EDC濃度對以Histidine修飾之奈米乳液其粒徑大小及表面電位之影響 63
圖46、Arginine/NE(w/w)的比例對Arginine修飾之奈米乳液其粒徑大小及表面電位之影響 65
圖47、Lysine/NE(w/w)的比例對Lysine修飾之奈米乳液其粒徑大小及表面電位之影響 66
圖48、Histidine/NE(w/w)的比例對Histidine修飾之奈米乳液其粒徑大小及表面電位之影響 67
圖49、以Arginine、Lysine、Histidine修飾之奈米乳液之轉染效率及存活率 69
圖50、Arginine修飾之奈米乳液以不同Arginine/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 71
圖51、Arginine修飾之奈米乳液以不同Arginine/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 71
圖52、Lysine修飾之奈米乳液以不同Lysine/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 72
圖53、Lysine修飾之奈米乳液以不同Lysine/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 72
圖54、Histidine修飾之奈米乳液以不同Histidine/DNA(w/w)比例對粒徑大小及表面電位之影響 73
圖55、Histidine修飾之奈米乳液以不同Histidine/DNA(w/w)比例對轉染效率及存活率之影響 73
圖56、Arginine修飾之奈米乳液以不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 76
圖57、Lysine修飾之奈米乳液以不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 77
圖58、Histidine修飾之奈米乳液以不同粒徑大小對轉染效率及存活率之影響 78
圖59、以胺基酸修飾的方式製備奈米乳液載體之穩定性 79
圖60、以Lysine修飾之奈米乳液與DNA連接的情形 80
圖61、製備之正電型奈米乳液與市售轉染效率比較 81

表1、純乳液之粒徑大小、表面電位及粒徑分佈指數 35
表2、添加不同陽離子界面活性劑1%之粒徑大小、表面電位及粒徑分佈指數 35
表3、均質時間對Ketramine奈米乳液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 44
表4、均質時間對Forestall奈米乳液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 44
表5、均質時間對Octadecylamine奈米乳液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 44
表6、均質時間對奈米乳液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 45
表7、均質時間對奈米乳液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 45
表8、含5%陽離子界面活性劑粒徑大小、表面電位及粒徑分佈指數 51
表9、不同Ketramine含量之粒徑大小、表面電位及粒徑分佈指數 53
表10、添加5% Ketramine不同均質時間對奈米乳液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 58
表11、純乳液之粒徑大小、表面電位及粒徑分佈指數 60
表12、以不同胺基酸修飾奈米乳液之粒徑大小、粒徑分佈及表面電位 69
表13、Arginine修飾之奈米乳液不同均質時間對粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 75
表14、Lysine修飾之奈米乳液不同均質時間對液粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 75
表15、Histidine修飾之奈米乳液不同均質時間對粒徑大小、粒徑分布指數與表面電位 75

Bett AJ, Prevec L, Graham FL. 1993. Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology 67(10):5911-5921.
Bivas-Benita M, Oudshoorn M, Romeijn S, van Meijgaarden K, Koerten H, van der Meulen H, Lambert G, Ottenhoff T, Benita S, Junginger Hao. 2004. Cationic submicron emulsions for pulmonary DNA immunization. Journal of Controlled Release 100(1):145-155.
Bloomfield V. 1991. Condensation of DNA by multivalent cations:consideration on mechanism. Biopolymers 31(1):1471-1481.
Bondi ML, Azzolina A, Craparo EF, Lampiasi N, Capuano G, Giammona G, Cervello M. 2007. Novel cationic solid-lipid nanoparticles as non-viral vectors for gene delivery. Journal of Drug Targeting 15(4):295-301.
Capek I. 2004. Degradation of kinetically-stable o/w emulsions. Advances in Colloid and Interface Science 107(2-3):125-155.
Chiesa M, Garg J, Kang YT, Chen G. 2008. Thermal conductivity and viscosity of water-in-oil nanoemulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 326(1-2):67-72.
Dang JM, Leong KW. 2006. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews 58(4):487-499.
De Smedt SC, Demeester J, Hennink WE. 2000. Cationic polymer based gene delivery systems. Pharmaceutical Research 17(2):113-126.
El-Aneed A. 2004. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. Journal of Controlled Release 94(1):1-14.
Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84(21):7413-7417.
Ferber D. 2001. Gene therapy: Safer and virus-free? Science 294(5547):1638-1642.
Floury J, Desrumaux A, Lardie?res J. 2000. Effect of high-pressure homogenization on droplet size distributions and rheological properties of model oil-in-water emulsions. Innovative Food Science and Emerging Technologies 1(2):127-134.
Fox CB, Anderson RC, Dutill TS, Goto Y, Reed SG, Vedvick TS. 2008. Monitoring the effects of component structure and source on formulation stability and adjuvant activity of oil-in-water emulsions. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 65(1):98-105.
Gaikwad SG, Pandit AB. 2008. Ultrasound emulsification: Effect of ultrasonic and physicochemical properties on dispersed phase volume and droplet size. Ultrasonics Sonochemistry 15(4):554-563.
Gershon H. 1993. Mode of formation and strctural features of DNA-cationic liposome complexes used for transfection. Biochemistry 32(28):7143-7151.
Gutierrez JM, Gonza?lez C, Maestro A, Sole I, Pey CM, Nolla J. 2008. Nano-emulsions: New applications and optimization of their preparation. Current Opinion in Colloid and Interface Science 13(4):245-251.
Hara T, Liu F, Liu D, Huang L. 1997. Emulsion formulations as a vector for gene delivery in vitro and in vivo. Advanced Drug Delivery Reviews 24(2-3):265-271.
Huard J, Li Y, Peng H, Fu FH. 2003. Gene therapy and tissue engineering for sports medicine. Journal of Gene Medicine 5(2):93-108.
Kim TW, Chung H, Kwon IC, Sung HC, Jeong SY. 2000. In vivo gene transfer to the mouse nasal cavity mucosa using a stable cationic lipid emulsion. Molecules and Cells 10(2):142-147.
Kusumoto KI, Akao T, Mizuki E, Nakamura O. 2006. Gene transfer effects on various cationic amphiphiles in CHO cells. Cytotechnology 51(2):57-66.
Kwon SM, Nam HY, Nam T, Park K, Lee S, Kim K, Kwon IC, Kim J, Kang D, Park JH and others. 2008. In vivo time-dependent gene expression of cationic lipid-based emulsion as a stable and biocompatible non-viral gene carrier. Journal of Controlled Release 128(1):89-97.
Lasic DD, Templeton NS. 1996. Liposomes in gene therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 20(2-3):221-266.
Liu F, Huang L. 2002. Development of non-viral vectors for systemic gene delivery. Journal of Controlled Release 78(1-3):259-266.
Lou D, Saltzman WM. 2000. Synthetic DNA delivery systems. Nature Biotechnology 18(1):33-37.
Mao C, Solis DJ, Reiss BD, Kottmann ST, Sweeney RY, Hayhurst A, Georgiou G, Iverson B, Belcher AM. 2004. Virus-Based Toolkit for the Directed Synthesis of Magnetic and Semiconducting Nanowires. Science 303(5655):213-217.
Mao C, Sun W, Shen Z, Seeman NC. 1999. A nanomechanical device based on the B-Z transition of DNA. Nature 397(6715):144-146.
Miller DG, Adam MA, Miller AD. 1990. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology 10(8):4239-4242.
Montana G, Bondi ML, Carrotta R, Picone P, Craparo EF, San Biagio PL, Giammona G, Di Carlo M. 2007. Employment of cationic solid-lipid nanoparticles as RNA carriers. Bioconjugate Chemistry 18(2):302-308.
Mortimer I, Tam P, MacLachlan I, Graham RW, Saravolac EG, Joshi PB. 1999. Cationic lipid-mediated transfection of cells in culture requires mitotic activity. Gene Therapy 6(3):403-411.
Muzyczka N. 1992. Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells. Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129.
Olbrich C, Bakowsky U, Lehr CM, Mu?ller RH, Kneuer C. 2001. Cationic solid-lipid nanoparticles can efficiently bind and transfect plasmid DNA. Journal of Controlled Release 77(3):345-355.
Partridge KA, Oreffo ROC. 2004. Gene Delivery in Bone Tissue Engineering: Progress and Prospects Using Viral and Nonviral Strategies. Tissue Engineering 10(1-2):295-307.
Schwartz B, Benoist C, Abdallah B, Rangara R, Hassan A, Scherman D, Demeneixb A. 1996. Gene transfer by naked DNA into adult mouse brain. Gene therapy 3(5):405-411
Solans C, Izquierdo P, Nolla J, Azemar N, Garcia-Celma MJ. 2005. Nano-emulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science 10(3-4):102-110.
Song J, Chappell JC, Qi M, VanGieson EJ, Kaul S, Price RJ. 2002. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. Journal of the American College of Cardiology 39(4):726-731.
Sung HW, Chang WH, Ma CY, Lee MH. 2003. Crosslinking of biological tissues using genipin and/or carbodiimide. Journal of Biomedical Materials Research - Part A 64(3):427-438.
Tadros T, Izquierdo P, Esquena J, Solans C. 2004. Formation and stability of nano-emulsions. Advances in Colloid and Interface Science 108-109:303-318.
Tamilvanan S. 2004. Oil-in-water lipid emulsions: Implications for parenteral and ocular delivering systems. Progress in Lipid Research 43(6):489-533.
Teixeira H, Dubernet C, Puisieux F, Benita S, Couvreur P. 1999. Submicron cationic emulsions as a new delivery system for oligonucleotides. Pharmaceutical Research 16(1):30-36.
Tseng WC, Haselton FR, Giorgio TD. 1999. Mitosis enhances transgene expression of plasmid delivered by cationic liposomes. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression 1445(1):53-64.
Yang NS, Sun WH. 1995. Gene gun and other non-viral approaches for cancer gene therapy. Nature Medicine 1(5):481-483.
Yoo HS, Kwon SM, Kim YJ, Chung H, Kwon IC, Kim J, Jeong SY. 2004. Cationic lipid emulsions containing heavy oils for the transfection of adherent cells. Journal of Controlled Release 98(1):179-188.
Zhang S, Xu Y, Wang B, Qiao W, Liu D, Li Z. 2004. Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery. Journal of Controlled Release 100(2):165-180.
郭俊賢，殷正華，蔣亞婷，林翠芊，郭光輝，奈米生技化妝品專利地圖及分析，台北市，科資中心，民93
陳福榮，張立，1995，場發射穿透式電子顯微鏡，科儀新知 ，16(4):4.
剎米孝夫，界面活性劑的原理與應用，王鳳英譯，台北市，高立圖書股份有限公司，民82。