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研究生:黃玉芬
研究生(外文):Huang Yu-Fen
論文名稱:Xanthomonas屬植物病原細菌之PCR檢測技術開發
論文名稱(外文):PCR techniques for identification of phytopathogenic bacteria in Xanthomonas
指導教授:朱木貴
指導教授(外文):Chu Mu-Kuei
學位類別:碩士
校院名稱:中華醫事科技大學
系所名稱:生物科技研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2009
畢業學年度:96
語文別:中文
論文頁數:73
中文關鍵詞:茄科細菌性斑點病菌十字花科黑腐病原細菌柑橘潰瘍病菌
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Xanthomonas屬之植物病原細菌為革蘭氏陰性、呈桿狀,具有一條極生鞭毛,通常會引起植物之重要病害。其中柑橘潰瘍病菌、十字花科黑腐病菌及茄科細菌性斑點病菌則為台灣地區常見之植物病原細菌,可引起許多經濟性蔬果之重要病害。為了能在早期鑑定出柑橘潰瘍病原細菌、十字花科黑腐病原細菌及茄科細菌性斑點病原細菌之感染,本研究利用internal transcribe spacer (ITS)與lytic enzyme序列結合PCR開發出快速之檢測技術,研究中將柑橘潰瘍病菌、十字花科黑腐病菌及茄科細菌性斑點病菌基因體中之ITS與lytic enzyme 等DNA進行選殖,利用生物資訊進行多序列分析,顯示不同種之Xanthomonas間的DNA序列具有較多的變異。利用序列之差異性可設計出專一性引子,成功的檢測出柑橘潰瘍病菌、十字花科黑腐病菌及茄科細菌性斑點病菌。在單一引子組PCR(Uniplex PCR)分析中能夠鑑定柑橘潰瘍病菌、十字花科黑腐病菌及茄科細菌性斑點病菌之差異性。研究中也進一步開發出以多引子組PCR (Multiplex PCR)技術來鑑定柑橘潰瘍病菌、十字花科黑腐病菌及茄科細菌性斑點病菌。本研究中也利用免疫磁珠分離(IMS)搭配PCR技術來達到分離及鑑定病原細菌之目的,葉片上之柑橘潰瘍病原細菌在免疫磁珠PCR檢測時之敏感度則介於101與102 cfu之間。
Xanthomonas phytopathogenic bacteria were gram-negative, rod-shaped, polarly-flagellated bacteria which members caused serious plant diseases usually. Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC) , Xanthomonas campestris pv. campestris (XCC) and Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (XAV) affected many economic plants which included vegetables and fruits in Taiwan. In order to identify XAC、XCC and XAV at the early stage of infection, we planed to develop a rapid detecting technique based on specific sequences of the internal spacer regions (ITS) or lytic enzyme. In this study, we cloned several DNA fragments of ITS and lytic enzyme from XAC、XCC and XAV. The bioinformatics analysis by multiple sequences alignment showed the diversity exist in different species of XAC、XCC and XAV. We designed specific primers based on the sequence (ITS and lytic enzyme) divergence and developed the detective method successfully. The development of specific uniplex-PCRs could detect XAC、XCC and XAV. We designed new multiplex-PCRs, could detect XAC、XCC and XAV at the same PCR reaction. In this project, we intended to combine the immuno-magnetic beads separation technique with the specific PCR detecting method to isolate the bacteria. This technique could isolate XAC from leafs and the sensitivity of immuno-magnetic PCR was 101 – 102 cfu.
目錄
中文摘要…………………………………………………………… I
英文摘要…………………………………………………………… Ⅱ
壹、前人研究……………………………………………………… 1
貳、材料與方法…………………………………………………… 1
一、 供試菌株之來源、培養與保存……………………………… 11
二、 抗體之製備………………………..………………………… 11
三、 供試菌株染色體DNA之純化……………………………… 11
四、 共通性引子組之設計……………………………………… 11
五、 聚合酵素連鎖反應(polymerase chain reaction PCR)… 12
六、 PCR產物之純化…………………………………………… 12
七、 PCR產物與質體之接合作用……………………………… 12
八、 核酸轉型作用……………………………………………… 13
九、 DNA定序與引子組設計…………………………………… 13
十、 單一引子組之專一性子檢測……………………………… 14
十一、 單一引子組之敏感度分析……………………………… 14
十二、 多引子組之專一性子檢測……………………………… 15
十三、 IgG抗體的純化………………………………………… 16
十四、 磁珠結合抗體之操作………………………………… 16
十五、 免疫磁珠之病原細菌分離法…………………………… 17
參、結果…………………………………………………………… 18
一、 XAC、XCC及XAV菌株之ITS核酸定序與分析………… 18
(一) XAC菌株之ITS核酸定序與分析……………………… 18

(二) XCC菌株之ITS核酸定序與分析……………………… 18
(三) XAV菌株之ITS核酸定序與分析……………………… 19
(四) XAC、XCC及XAV之ITS核酸定序與分析…………… 19
二、 XAC、XCC及XAV菌株Lytic enzyme核酸定序與分析 20
三、 單一引子組之專一性分析……………………………… 21
(一) ITS單一引子組之專一性檢測…………………………… 21
1. XCC之專一性檢測……………………………………… 21
2. XAC之專一性檢測……...……………………………… 21
3. XAV之專一性檢測……………………………………… 22
(二) LE單一引子組之專一性檢測…………………… 22
1. XCC之專一性檢測………………………………………... 22
2. XAC之專一性檢測………………...……………………… 22
3. XAV之專一性檢測………………………………………... 23
四、 專一性引子之偵測敏感度分析………………………… 23
(一) XCC專一性引子之偵測敏感度…………………………… 23
1. 引子組XCC-ITS-F/ Xan-16S-R之PCR敏感度分析…...… 23
2. 引子組XCC-LE2-F/ XCC-LE2-R之PCR敏感度分析…… 23
3. 引子組XCC-LE4-F/ Xan-Lytic-R之PCR敏感度分析........ 23
(二) XAC專一性引子之偵測敏感度…………………………… 24
1. 引子組XAC-ITS-F/ XAC-ITS-R之敏感度分析….……… 24
2. 引子組Xan-Lytic-F/ XAC-LE4-R之敏感度分析……….... 24
(三) XAV專一性引子偵測敏感度分析………………………… 24
1. 引子組XAV-ITS-F/ Xan-16S-R之敏感度分析….……….. 24

2. 引子組XAV-LE4-F/ Xan-Lytic-R之敏感度分析.……….. 25
五、 Multiplex PCR在檢測上之應用………………………… 25
(一) 雙引子組對單一DNA之檢測…………………………… 25
(二) 多引子組對單一DNA之檢測…………………………… 25
(三) 單一引子組對多種DNA之檢測………………………… 25
(四) 三引子組對單一DNA之檢測…………………………… 26
(五) 三引子組對三種DNA之檢測…………………………… 26
六、 免疫磁株分離細菌之效果分析…………………………… 27
肆、討論…………………………………………………………… 28
伍、參考文獻……………………………………………………… 33
陸、圖表…………………………………………………………… 39
柒、附錄…………………………………………………………… 69
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