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研究生:江靜慧
研究生(外文):Ching-Hui Chiang
論文名稱:探討流感病毒(H1N1)核殼蛋白與核醣核酸結合作用的決定性胺基酸
論文名稱(外文):Probing the crucial residues of influenza virus (H1N1) nucleoprotein for RNA-binding
指導教授:侯明宏
指導教授(外文):Ming-Hon Hou
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:生物科技學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
畢業學年度:97
語文別:中文
論文頁數:70
中文關鍵詞:流感病毒核殼蛋白核醣核酸
外文關鍵詞:influenza virusnucleoproteinRNA
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H1N1屬於A型流感病毒,其核殼蛋白 (nucleoprotein) 是病毒顆粒中主要之結構蛋白,可與負股病毒核醣核酸產生交互作用,以及構成病毒核衣殼(nucleocapsid)。核殼蛋白的結晶結構已在2006年的Nature期刊被確認出來,此研究報告發表了核殼蛋白的結構,位於核殼蛋白多聚體外側有個深入的凹槽,此處很有可能是核醣核酸的結合位置。因此,作者指出大量覆蓋在凹槽表面的鹼性胺基酸 (包含R65、R150、R152、R156、R174、R175、K184、R195、R199、R213、R214、R221、R236、R355、K357、R361以及R391)可以和磷酸雙酯骨架 (phosphodiester backbone) 互相作用。而且芳香族胺基酸Y148也被提及其苯環可能會與核甘鹼基產生堆疊現象。為了探討核殼蛋白與核醣核酸之間的結合機制,我們個別進行了定點突變,並且透過生物物理學的分析方式例如表面薄膜共振技術、圓二色光譜儀與螢光光譜儀來確認影響核醣核酸結合的重要胺基酸。實驗結果顯示,以圓二色光譜分析後發現wild type H1N1 核殼蛋白為一結構完整的蛋白,其二級結構中α-helix約占45%、β-strand約占19%、turn約佔14%以及unordered structure約有22%,18個mutant type H1N1核殼蛋白其二級結構整體構形與wild type H1N1核殼蛋白相似,當wild type H1N1核殼蛋白、18個mutant type H1N11核殼蛋白與RNA結合時,其二級結構亦相似。在熱穩定分析中,wild type核殼蛋白Tm值可高達68℃。由螢光光譜儀分析可知,18個mutant type H1N1核殼蛋白表面之tryptophan環境發生些微改變。另外,從表面薄膜共振技術結果得知,核殼蛋白表面的R65、R150、R152、R156、R174、R175、K184、R195、R199、R213、R214、R221、R236、R355、K357、R361以及R391皆參與RNA結合作用。相較於wild type H1N1核殼蛋白,這18個mutant type H1N1核殼蛋白皆有結合常數降低與解離常數提高之趨勢。除此之外,R65A、R152A、R174A、R213A、R221A以及R391A比起另外12個mutant type H1N1核殼蛋白,明顯表現出低結合常數、高解離常數的現象。這些研究結果在未來也許有助於藥物發展,能應用在中斷流感病毒核殼蛋白與核醣核酸結合作用以及病毒的聚集現象。
目錄


中文摘要 i
英文摘要 iii
圖目次 viii
表目次 x
第一章 緒論 1
一. 流感病毒 (influenza virus) 1
二. 流感病毒結構蛋白及其功能 1
三. 流感病毒感染宿主細胞過程 3
四. 流感病毒分類與命名 4
五. 流感病毒H1N1簡介 5
六. 流感病毒H1N1核殼蛋白 (nucleocapsid protein, N protein) 6
七. 研究動機 8
第二章 材料與方法 9
一. 實驗材料 9
(一) 化學藥品 9
(二) 有機溶劑 10
(三) 限制酶 (restriction enzymes) 與相關酵素 10
(四) 載體 (vector) 與勝任細胞 (competent cell) 10
(五) 培養基 11
(六) 電泳緩衝液、染劑與相關材料 11
(七) 商業套組 11
(八) 感應晶片 11
二. 實驗儀器設備 12
三. 實驗流程 13
四. 實驗方法 13
(一) 基因選殖 13
(二) 定點突變 (Site-directed mutagenesis) 15
(三) 蛋白質純化 18
(四) 蛋白質定量 21
(五) 蛋白質聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-PAGE) 分析 22
(六) 生物分子交互作用分析系統 (Biomolecular interaction 23
analysis, BIAcore) 23
(七) 圓二色光譜 (Circular dichroism spectra) 分析 26
(八) 螢光光譜儀 (Fluorescence Spectroscopy) 分析 31
第三章 實驗結果 33
一. 定點突變 33
二. 蛋白質表現與純化 33
三. 蛋白質與RNA結合之活性分析 33
四. 蛋白質穩定性分析 35
五. 蛋白質構形分析 35
六. 蛋白質與RNA結合之構形分析 36
第四章 討論 37
一. 序列比對 (Alignment) 37
二. 定點突變 37
三. 蛋白質表現與純化 38
四. 蛋白質與RNA結合之活性分析 38
五. 蛋白質穩定性分析 40
六. 蛋白質構形分析 41
七. 蛋白質與RNA結合之構形分析 41
第五章 結論與未來展望 43
第六章 參考文獻 44
第七章 圖次 49

圖目次


圖1. H1N1 (New York)、H5N1、H1N1 (Swine) 與B型流感病毒之核殼蛋白序列比對 49
圖2. H1N1 (New York) 核殼蛋白之二級結構分佈 50
圖3.重組wild type 與mutant type H1N1核殼蛋白之鎳親和性管柱純化。 51
圖4.重組mutant type H1N1核殼蛋白之鎳親和性管柱純化 52
圖5. Wild type H1N1核殼蛋白之SPR分析 53
圖6. Wild type與mutant type (K184A、K214A、K236A、K357A) H1N1核殼蛋白之SPR分析 54
圖7. Wild type與mutant type (Y148A、R156A、R195A、R355A) H1N1核殼蛋白之SPR分析 55
圖8. Wild type與mutant type (R150A、R175A、R199A、R361A) H1N1核殼蛋白之SPR分析 56
圖9. Wild type與mutant type (R65A、R152A、R174A、R213A、R221A、R391A) H1N1核殼蛋白之SPR分析 57
圖10. H1N1 (New York) 核殼蛋白之同源模擬 58
圖11.不同溫度下wild type H1N1核殼蛋白之全波長掃描 59
圖12. Wild type H1N1核殼蛋白之熱穩定性分析 60
圖13. Wild type與mutant type (R65A、Y148A、R150A、R152A、R156A、R174A) H1N1核殼蛋白之圓二色光譜分析 61
圖14. Wild type與mutant type (R175A、K184A、R195A、R199A、R213A、K214A) H1N1核殼蛋白之圓二色光譜分析 62
圖15. Wild type與mutant type (R221A、K236A、R355A、K357A、R361A、R391A) H1N1核殼蛋白之圓二色光譜分析 63
圖16. Wild type與mutant type (R65A、Y148A、R150A、R152A、R156A、R174A) H1N1核殼蛋白之螢光光譜分析 64
圖17. Wild type與mutant type (R175A、K184A、R195A、R199A、R213A、K214A) H1N1核殼蛋白之螢光光譜分析 65
圖18. Wild type與mutant type (R221A、K236A、R355A、K357A、R361A、R391A) H1N1核殼蛋白之螢光光譜分析 66




表目次


表1. H1N1核殼蛋白定點突變之引子設計 67
表2. H1N1核殼蛋白與RNA結合之動力學分析 68
表3. 利用CDPro程式進行wild type與mutnat type H1N1核殼蛋白之二級結構預測 69
表4. 利用CDPro程式進行mutnat type H1N1核殼蛋白之二級結構預測 70
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