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研究生:黃裕仁
研究生(外文):Yu-Ren Huang
論文名稱:Vogesellasp.分泌之魚鱗水解酵素之特性及純化
論文名稱(外文):Purification and characterization of a fish scale-degrading protease from Vogesella sp.
指導教授:郭建民郭建民引用關係
指導教授(外文):Jen-Min Kuo
學位類別:碩士
校院名稱:國立高雄海洋科技大學
系所名稱:水產食品科學研究所
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2009
畢業學年度:97
語文別:中文
論文頁數:93
中文關鍵詞:Vogesella sp.純化蛋白酶魚鱗微生物
外文關鍵詞:Vogesella sp.purificationproteasefish scalemicroorganism
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本研究目的乃探討由魚鱗分離得到新菌株Vogesella sp.7307-1之特性及其分泌的蛋白酶之分離純化與性質。將Vogesella sp.7307-1培養4天,離心過濾獲得之澄清液為粗酵素液。將粗酵素液經20-80%飽和硫酸銨分劃,Q FF陰離子管柱層析及Superdex 200膠過濾管柱分離純化後,蛋白酶純化35.65倍,回收率9.96%。純化酵素分子量為119 kDa,Km為0.067mM,Vmax為425.5 U/mg-min。該純化酵素最適作用pH為7.5,pH 7.5〜9.0酵素活性穩定,酵素活性最適溫度為50℃,60℃以下酵素活性穩定。酵素活性會被金屬離子Cu2+、Hg2+、蛋白酶抑制劑EDTA (ethylene diamine teraacetates)、界面活性劑SDS (sodiumdodecylsulfate)和還原劑β-mercaptoethanol抑制,但會受到界面活性劑Triton X-100活化。將7307-1粗酵素液貯藏於4或-20℃下10星期後仍維持84.5%以上的酵素活性,貯存於25℃下4週後酵素活性剩下39.9%。魚鱗經7307-1分泌的酵素水解後,可獲得低分子量胜肽水解物 (< 3 kDa)。
The objective of the present study is to purify and characterize the proteinase from Vogesella sp.7307-1 which was newly identified and isolated from fish scale. The proteinase was extracted, isolated, and purified 35.65-fold with recovery 9.96% using 20-80% saturation of ammonium sulfate fractionation, Q FF ion exchange chromatography and Superdex 200 gelfiltration. The molecular mass of the purified enzyme was 119 kDa. The Km and Vmax was 0.067 mM and 425.5 U/mg-min, respectively using azo-casein as substrate. The optimum pH of the purified enzyme was 7.5, and optimum temperature was 50℃. At temperature below 60℃ or pH ranged from 7.5 to 9.0, the enzyme was stable. Metal ion (including Cu2+、Hg2+), SDS (sodiumdodecylsulphate) and β-mercaptoethanol could inhibit enzyme activity while Triton X-100 could slight activate the enzyme activity. Moreover, the enzyme activity of the purified proteinase was completely inhibited by EDTA (ethylene diamine teraacetates), indicating the purified enzyme was probably a metalloproteinase. The crude proteinase retained more than 84.5% of enzyme activity at 4 or -20℃ for 10 weeks, and 39.9% at 25℃ for 4 weeks. Hydrolysates from fish scale treated with 7307-1 protease were found having the low MW peptides (< 3 kDa).
目錄
中文摘要 Ⅰ
英文摘要 Ⅱ
誌謝 Ⅲ
目錄 Ⅳ
表目錄 Ⅷ
圖目錄 Ⅸ
附表目錄 XI
附圖目錄 XII
壹、前言 1
貮、文獻回顧 2
一、Vogesella sp.簡介 2
(一)菌種命名 2
(二)自然棲息地 2
(三)適合生長環境 2
(四)大小、形態及生化特性 2
(五)Vogesella sp.之研究與應用 3
二、蛋白酶 4
(一)蛋白酶之簡介 4
(二)蛋白酶的分類 4
(三)蛋白酶於工業上之應用 8
三、膠原蛋白 11
(一)膠原蛋白簡介 11
(二)膠原蛋白結構 11
(三)膠原蛋白之類型與分佈 11
(四)膠原蛋白胜肽 14
(五)膠原蛋白之應用 16
四、魚鱗膠原蛋白 18
(一)魚鱗簡介 18
(二)魚鱗廢棄概況 19
(三)魚鱗組成分 19
(四)魚鱗膠原蛋白相關之研究 19
參、材料與方法 21
一、材料 21
(一)菌株來源 21
(二)培養基 21
(三)藥品 22
(四)儀器與設備 23
二、菌株分離及鑑定 24
(一)菌株分離 24
(二)菌株之保存 24
(三)菌株之活化 25
(四)菌種鑑定及生化特性 25
三、實驗方法 29
  (一)分子量分析 29
(二)蛋白酶活性測定方法:Azocasein分析方法 29
(三)魚鱗水解物含量測定:O-phthalaldehyde呈色法 30
(四)蛋白質濃度測定 31
(五)茚三酮反應測定 32
(六)Native-PAGE 33
(七)SDS-PAGE 35
(八)銀染方法 37
(九)活性染色 38
四、實驗架構 39
五、試驗步驟 40
(一)粗酵素液的製備 40
(二)硫酸銨分劃 40
(三)陰離子交換管柱層析 40
(四)膠過濾管柱層析 40
(五)酵素一般生化特性之測定 41
(六)酵素生化性質分析 41
(七)工業應用條件初步探討 43
肆、結果與討論 45
ㄧ、Vogesella sp. 7307-1之菌株篩選與特性描述及鑑定 45
(一)菌株篩選 45
(二)菌種鑑定 45
(三)菌株特性描述 45
二、Vogesella sp. 7307-1蛋白酶之純化 53
(ㄧ)粗酵素液的製備 53
(二)硫銨分劃 53
(三)陰離子交換樹脂層析 53
(四)Superdex 200管柱膠過濾層析 53
(五)電泳分析 53
三、7307-1蛋白酶之最適作用條件及安定性 62
(ㄧ)最適pH及溫度 62
(二)pH安定性及熱安定性 62
四、7307-1蛋白酶之生化特性 68
(ㄧ)蛋白酶抑制劑對酵素活性影響 68
(二)金屬離子對酵素活性之影響 68
(三)有機溶劑、界面活性劑、還原劑對酵素活性影響 68
(四)酵素動力學探討 68
(五)基質特異性探討 69
(六)酵素與市售蛋白酶水解能力探討 69
五、工業應用條件初步探討 78
(ㄧ)蛋白酶保存性 78
(二)魚鱗膠原蛋白胜肽的製備 78
(三)7307-1蛋白酶處理魚鱗之回收率 78
伍、結論 84
陸、參考文獻 86
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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