中文摘要


本研究嘗試以多種酵素組合生產石蓴寡醣，並區別寡醣組成成分、及探討其抗氧化、抗凝血、對胺酸?活性抑制能力、及對人類 黑色素腫瘤細胞 (A375 cell) 與人類皮膚纖維母細胞 (CCD-966SK cell) 之影響等生理活性。以 ulvan 誘導 Aeromonas salmonicida MAEF108 與 Pseudomonas vesicularis MA103 所產的粗酵素液，分別命名為 UI-8 與 UI-3，並使用 0.2 U/mL 之酵素用量，於 40oC下 水解石蓴熱萃多醣液 (ulvan)，所產之石蓴寡醣 (< 3 kDa) 其產率高達 28%；使用 5 U/mL cellulase 於 37oC 下所產之石蓴寡醣 (< 3 kDa)，其產率為 12%，相較下高出約 2.3 倍。抗氧化能力方面，清除 DPPH 自由基能力與螯合亞鐵離子能力，Ulvan 以 0.2 U/mL 之 UI-8 與 UI-3接續反應後，所產之石蓴寡醣 (> 3 kDa 與 < 3 kDa) 個別可達 17.94%、35.85% 與 9.48%、40.90%。抗凝血活性方面，以 UI-8 與 UI-3 水解 ulvan 所產之石蓴寡醣，於人血漿測定凝血?原時間 (prothrombin time, PT) 與活化部份凝血活?時間 (activited partial thromboplastin time, APTT)。在 PT 測定中，石蓴寡醣與對照組之 吸光值相似，且無延長 PT；於 APTT測試中，石蓴寡醣之吸光值比對照組高。於 40oC下，Ulvan 經 UI-8與UI-3 接續反應，所產之 石蓴寡醣 (< 3 kDa)，以 62.5 �慊/mL濃度下，對酪氨酸?抑制能力達 25%；3.91 - 2000 �慊/mL石蓴寡醣 (> 3 kDa 與 < 3 kDa) 培養 48 hr下，可抑制A375 cell，存活率約 57 - 65%；250 - 2000 �慊/mL的石蓴寡醣 (> 3 kDa 與 < 3 kDa) 培養 24 hr下，CCD-966SK cell 存活率 高達 120 - 220%，顯示對CCD -966SK cell 有增生之效果。於40 oC下，Ulvan經 UI-8 與 UI-3 接續反應後，所產之石蓴寡醣 (< 3 kDa)，不僅提高石蓴寡醣之產率，且具抗氧化、能有效抑制 A375 cell、及對 CCD -966SK cell 有增生效果，且具有開發為新型態保健食品或 皮膚保養品之潛力。

Abstract

This study attempts to produce oligosaccharides of Ulva by various enzymes combinations and distinction the oligosaccharide composition, their antioxidant properties, anticoagulant, tyrosinase inhibition activity, effect on human malignant melanoma cells (A375 cell), and human skin fibroblast (CCD-966SK cell) were studied. The crude enzymes from Aeromonas salmonicida MAEF108 and Pseudomonas vesicularis MA103 which were induced by ulvan named UI-8 and UI-3, respectively. Additionally, ulvan were hydrolyzed by 0.2 U/mL of UI-8 and UI-3 which followed up reaction at 40oC to produce oligosaccharides of Ulva. The yield of oligosaccharides of Ulva (< 3 kDa) were as high as 28%, on the other hand, by 5 U/mL cellulase at 37oC reaction then the yield were 12%. In evaluating the yield of oligosaccharides, ulvan were hydrolyzed by UI-8 and UI-3 to produce higher about 2.3 folders than by cellulase. 0.2 U/mL UI-8 and UI-3 which followed up reaction at 40oC to produce Ulva oligosaccharides > 3 kDa (OS-UI-4 > 3 kDa) and < 3 kDa (OS-UI-4 < 3 kDa). In terms of antioxidative activities, the scavenging effect on DPPH free radicals in OS-UI-4 > 3 kDa and OS-UI-4 < 3 kDa were 17.94% and 35.85%. In evaluating the chelating effects on ferrous ions, OS-UI-4 > 3 kDa and OS-UI-4 < 3 kDa were 9.48% and 40.90%. Ulvan were hydrolyzed by UI-8 and UI-3 to prodce oligosaccharides of Ulva (OS-UI). In the experiment of anticoagulant activities, the analysis by prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) on human plasma. In the analysis of PT, OS-UI and control group were similar to the optical density (OD660nm) and no extension for PT. In the analysis of APTT, the optical densities of OS-UI were higher than control group. In term of tyrosinase inhibition activity was highest in OS-UI-4 < 3 kDa of 62.5 �慊/mL (about 25%). OS-UI-4 > 3 kDa and OS-UI-4 < 3 kDa of 3.91 to 2000 �慊/mL were cultured on A375 cell for 48 hr. Experimental data showed cell viability of A375 cell were about 57 - 65%. OS-UI-4 > 3 kDa and OS-UI-4 < 3 kDa of 250 - 2000 �慊/mL were cultured on CCD-966SK cell for 24 hr. The result showed cell viablitiy of CCD-966SK cell were as high as 120 - 220%. In coclusion, OS-UI-4 > 3 kDa and OS-UI-4 < 3 kDa showed antioxidant activities promotion, A375 cell inhibition effect, and CCD-966SK cell proliferation effect, serving as the basis for development of a novel form of health food or the skin care products in the future.

目錄


目錄 i
表目錄 vii
圖目錄 ix
附錄 xiii
中文摘要 xiv
英文摘要 xv
壹、前言 01
貳、文獻整理 03
一、海藻 03
1-1. 大型藻類 03
1-2. 微藻 04
二、石蓴 04
2-1. 石蓴 (Ulva lactuca) 之來源與應用 05
2-2. 石蓴之成份與營養價值 05
2-3. 石蓴多醣與石蓴寡醣之生理活性 07
三、海藻多醣 07
3-1. 海藻多醣之定義與特性 07
3-2. 海藻多醣之萃取方法 09
3-3. 海藻多醣之應用 09
3-4. 海藻多醣之生理活性 10
四、海藻寡醣 11
4-1. 海藻寡醣之萃取方法 11
4-2. 海藻寡醣之生理活性 12
五、洋菜?之介紹與應用 14
5-1. 洋菜? 14
5-2. 藻類原生質體之製作 14
5-3. 海藻多醣之生產與黏度降低 15
5-4. 藻類組成之分析 15
六、海藻多醣與海藻寡醣之洋菜?水解物 16
6-1. 生理活性 16
6-1-1. 免疫性 16
6-1-2. 益菌性 16
6-1-3. 抗氧化性 17
6-1-4. 抗凝血 19
6-1-5. 抗病毒 20
6-1-6. 抗制突變 21
6-1-7. 抑制血管收縮素轉化酵素 23
6-2. 應用 23
6-2-1. 美白應用 23
6-2-2. 藻類防禦反應 24
6-3. 抗凝血活性測定 25
6-3-1. 凝血原?時間 (Prothrombin time, PT) 25
6-3-2. 活化部份凝血活?時間 (Activited partial thromboplastin time, APTT) 26
七、海藻寡醣組成成分鑑定 26
7-1. 薄層層析法 (Thin-layer chromatography, TLC) 26
7-2. 高效能液相層析法 (High-performance liquid chromatography, HPLC) 27
7-3. 傅立葉轉換紅外線吸收光譜法 (Fourier-transformed
infrared spectroscopy, FTIR) 28
7-4. 磁核共振光譜法 (Nuclear magnetic resonance, NMR) 28
7-5. 液相層析串連質譜分析法 (Liquid chromatography/
mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS-MS) 29
參、實驗設計 31
肆、實驗材料與方法 32
一、實驗材料 32
1-1. 原料 32
1-2. 實驗菌株與細胞株 32
1-2-1. 洋菜?生產菌株 32
1-2-2. 細胞株 34
1-3. 試驗藥品 34
1-4. 儀器設備 35
1-5. 培養基組成 36
1-6. 洋菜?反應基質 37
1-7. 石蓴誘導酵素反應基質 37
1-8. DNS 溶液 37
二、實驗方法 37
2-1. 菌種保存與活化 37
2-1-1. 菌株保存 37
2-1-2. 菌株活化 38
2-2. 一般成份分析 38
2-2-1. 水分 38
2-2-2. 灰分 38
2-2-3. 粗蛋白 38
2-2-4. 粗脂肪 39
2-3. 洋菜?之生產與活性測定 39
2-3-1. 洋菜?之生產 39
2-3-2. 洋菜?的活性測定 40
2-4. 經 ulvan 誘導 Pseudomonas vesicularis
MA103 與 Aeromonas salmonicida MAEF108
所產之粗酵素液與其活性測定 40
2-4-1. 石蓴熱萃多醣液之製備 40
2-4-2. 菌株活化與誘導 40
2-4-3. 石蓴誘導酵素之最佳誘導條件 41
2-4-3-1. 誘導時間與溫度 41
2-4-3-2. 反應基質 41
2-4-4. 石蓴誘導酵素之生產 41
2-4-5. 石蓴誘導酵素的活性測定 42
2-5. 石蓴熱萃多醣液、石蓴寡醣酵素水解液、
石蓴寡醣區分液、及其寡醣產物分析 42
2-5-1. 酵素篩選 42
2-5-2. 酵素用量 42
2-5-3. 石蓴寡醣區分液之生產 43
2-5-4. SephacrylR S-200 HR 膠體過濾層析 43
2-5-5. 總醣量測定 43
2-5-6. 還原醣測定 44
2-5-7. 硫酸基含量測定 44
2-5-8. HPLC 分析 45
2-6. 石蓴寡醣酵素水解液與石蓴寡醣區分液之
抗氧化活性 45
2-6-1. 清除DPPH 自由基能力之測定 45
2-6-2. 亞鐵離子螯鐵能力之測定 45
2-7. 以石蓴寡醣區分液評估美白效果 46
2-7-1. 抑制酪胺酸?活性測定 46
2-7-2. 對人類黑色素腫瘤細胞 (A375 cell) 存活率
的影響 46
2-8. 以石蓴寡醣區分液評估抗老化之功效 47
2-8-1. 細胞培養 47
2-8-2. 細胞存活率 (MTT assay) 47
2-8-3. 對人類皮膚纖維母細胞 (CCD-966SK cell)
存活率的影響 48
2-9. 石蓴寡醣酵素水解液與石蓴寡醣區分液之
抗凝血活性 48
2-9-1. 凝血?原時間 (Prothrombin time, PT) 48
2-9-2. 活化部份凝血活?時間 (Activited partial thromboplastin time, APTT) 48
2-10. 統計分析 48
伍、結果與討論 49
一、成份分析 49
二、石蓴熱萃多醣液 (ulvan) 之醣類分析 49
三、石蓴寡醣之生產條件探討 50
3-1. 以六種市售酵素、MA103-crude agarases、或
MAEF108-crude agarases水解 ulvan 50
3-2. 探討以 ulvan 誘導P. vesicularis
MA103 與 A. salmonicida MAEF108
所產的粗酵素液 (UI-3與UI-8) 之誘導條件 51
3-3. 以UI-3 與 UI-8 水解 ulvan 52
3-4. 比較多種酵素組合生產石蓴寡醣 (OS-U2) 之產率 53
四、石蓴寡醣之生理活性 54
4-1. 抗氧化 54
4-2. 抗凝血 55
4-3. 對胺酸?活性抑制能力及對人類黑色素腫瘤細胞
(A375 cell) 之影響 57
4-4. 對人類皮膚纖維母細胞 (CCD-966SK cell) 之影響 57
陸、結論 59
柒、參考文獻 61
捌、附錄 114

表目錄
表一、石蓴粉末的一般成份 72
表二、2% 與 5% (w/v) 石蓴多醣熱萃液經 1 kDa 膜超過濾
去鹽前後之pH、總醣量、及還原醣含量 73
表三、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液 (pH 5.6) 經 5 U/mL
alginate lysase、��-amylase、cellulase、
-glucuronidase、macerozyme、MA103-crude agarases、
MAEF108-crude agarases、或 xylanase 於其最適溫度與
pH 條件下水解24 hr 之pH、總醣量、 及硫酸基含量 74
表四、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣經上述 8 種酵素水解 24 hr後，並經
3 kDa 膜超過濾得到 < 3 kDa 石蓴寡醣水解區分液的寡醣產率 75
表五、經0.15% ulvan誘導 P. vesicularis MA103 與
A. salmonicida MAEF108 所產之粗酵素液
(UI-3與UI-8) 的酵素活性 76
表六、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之UI-3
與UI-8 於 30oC 或 40oC 水解 48 hr 後之pH、
總醣量與硫酸基含量 77
表七、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC水解 48 hr 後之pH、
總醣量、及硫酸基含量 78
表八、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC水解 48 hr 後之總醣量與硫酸基含量 79
表九、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC 水解 48 hr 後並經超過濾區分出 2 段寡醣水解區分液(< 3 與 > 3 kDa) 之總醣量與硫酸基含量 80
表十、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣經 0.2 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC 水解 48 hr並
經 3 kDa 膜超過濾得到 < 3 kDa 石蓴寡醣水解區分液的寡醣產率 81
表十一、 2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之UI-3 與 UI-8 於 30oC 或 40oC 水解 48 hr 後對 DPPH 自由基之清除效應、及對亞鐵離子
螯合效應 82
表十二、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC 水解 48 hr 後
對 DPPH 自由基之清除效應、及對亞鐵離子 螯合效應 83
表十三、 2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC 水解 48 hr 後
對 DPPH 自由基之清除效應、及對亞鐵離子 螯合效應 84
表十四、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之UI-3
與 UI-8 於 30oC 或 40oC水解 48 hr 後並
經超過濾區分出 2 段寡醣水解區分液 ( < 3 與 > 3 kDa) 之對 DPPH 自由基之清除效應、及對亞鐵離子螯合效應 85

圖目錄
圖一、石蓴熱萃多醣液之SephacrylR S-200 HR膠體
過濾層析圖 86
圖二、石蓴熱萃多醣液經 3 kDa 膜超過濾得到
< 3 kDa 石蓴寡醣區分液之高效能液相層析圖 87
圖三、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液 (pH 5.6) 經 5 U/mL
alginate lysase、��-amylase、cellulase、��-gluc-
uronidase、macerozyme、MA103-crude agarases、
MAEF108-crude agarases、或 xylanase 於其
最適溫度與pH條件下水解 24 hr 後之還原醣含量變化 88
圖四、以 5 U/mL (a) alginate lysase、(b) ��-amylase、
(c) cellulase、或 (d) ��-glucuronidase、水解
2% (w/v) 石蓴多醣熱萃液 24 hr 並經 3 kDa
膜超過濾得到 < 3 kDa 石蓴寡醣水解區分液
之高效能液相層析圖 89
圖五、以 5 U/mL (a) macerozyme、(b) MA103-crude
agarases、(c) MAEF108-crude agarases、或 (d)
xylanase水解 2% (w/v) 石蓴多醣熱萃液 24 hr
並經 3 kDa 膜超過濾得到 < 3 kDa 石蓴寡醣
水解區分液之高效能液相層析圖 90
圖六、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之UI-3與UI-8 於 (a) 30oC 或 (b) 40oC水解 48 hr之還原醣含量變化 91
圖七、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之 UI-3 與 UI-8 於 (a) 30oC 或 (b) 40oC水解 48 hr 之還原醣含量變化 92
圖八、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之UI-3 與 UI-8 於 (a) 30oC、或(b) 40oC水解 48 hr 之還原醣含量變化 93
圖九、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經的UI-3 與 UI-8 以
(a) OS-U2-UI-8-0.2-30、(b) OS-U2-UI-83-0.2-30、
(c) OS-U2-UI-83-0.2-40之水解條件水解 48 hr 後並經 3 kDa 膜超過濾得到 < 3 kDa 石蓴寡醣之高效能液相層析圖 94
圖十、以不同濃度之 > 3kDa 及 < 3 kDa 之石蓴寡醣
(OS-U2-UI-83-0.2-40) 或 Vitamine C 對
酪胺酸?活性抑制變化 95
圖十一、以不同濃度之 > 3kDa 及 < 3 kDa之石蓴寡醣
(OS-U2-UI-83-0.2-40) 培養 24 hr，對人類皮膚
黑色素瘤細胞 A375 成長的影響 96
圖十二、以不同濃度之 > 3kDa 及 < 3 kDa之石蓴寡醣
(OS-U2-UI-83-0.2-40) 培養 48 hr，對人類皮膚
黑色素瘤細胞 A375 成長的影響 97
圖十三、以不同濃度之 > 3kDa 及 < 3 kDa之石蓴寡醣
(OS-U2-UI-83-0.2-40) 培養 24 hr，對人類皮膚
纖維母細胞 CCD-966SK 成長的影響 98
圖十四、以不同濃度之 > 3kDa 及 < 3 kDa之石蓴寡醣
(OS-U2-UI-83-0.2-40) 培養 48 hr，對人類皮膚
纖維母細胞 CCD-966SK 成長的影響 99
圖十五、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之以
UI-3 與UI-8 於 30oC 水解 48 hr 於兔血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 100
圖十六、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之
UI-3 與 UI-8 於 40oC 水解 48 hr 於兔血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 101
圖十七、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之
UI-3 與UI-8 於 30oC 水解 48 hr 於兔血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 102
圖十八、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之
UI-3 與 UI-8 於 40oC 水解 48 hr 於兔血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 103
圖十九、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之
UI-3 與 UI-8 於 30oC 水解 48 hr 於兔血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 104
圖二十、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之
UI-3 與UI-8 於 40oC 水解 48 hr 於兔血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 105
圖二十一、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之
UI-8 於 30oC 水解 48 hr並經超過濾區分出
2段寡醣水解區分液 ( < 3 kDa 與 > 3 kDa OS-U2-UI-8-0.2-30) 於兔血漿之凝血?原時間 與活化部份凝血活?時間 106
圖二十二、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之
UI-3 與 UI-8 於 30oC 水解 48 hr 於人血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 107
圖二十三、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.05 U/mL 之
UI-3 與UI-8 於 40oC水解 48 hr 於人血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 108
圖二十四、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之
UI-3 與 UI-8 於 30oC 水解 48 hr 於人血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 109
圖二十五、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.1 U/mL 之
UI-3 與UI-8 於 40oC 水解 48 hr 於人血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 110
圖二十六、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之
UI-3 與 UI-8 於 30oC 水解 48 hr 於人血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 111
圖二十七、2% (w/v) 石蓴熱萃多醣液經 0.2 U/mL 之
UI-3 與UI-8 於 40oC 水解 48 hr 於人血漿之
凝血?原時間與活化部份凝血活?時間 112

附錄目錄
附錄一、Agarose 的基本構造及洋菜?作用位置 113
附錄二、凝固試驗流程圖 114
附錄三、凝血?原時間與活化部份凝血活?時間之路徑圖 115
附錄四、標準品Blue dextran (200 kDa) 與 rhamnose
(182.2 Da) 於 SephacrylR S-200 HR 膠體過濾層析中的分佈情況 116
附錄五、Alginate lysase、��-amylase、cellulase、��-glucuronidase、macerozyme、MA103-crude agarases、MAEF108-crude agarases、及 xylanase 之最適溫度與pH 117
附錄六、標準品 (a) arabinose 與 maltose、(b) galactose、
(c) rhamnose 與 lactose、及 (d) xylose 與 sucrose之高效能液相層析圖 118
附錄 7、 以 HPLC 分析下之石蓴寡醣區分液 (< 3 kDa)
的積分面積 119

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