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研究生:劉思妤
研究生(外文):Sz-Yu
論文名稱:探討Slit2 蛋白C端的不同區域對人類肺癌細胞株CL1-5生長與侵襲之影響
論文名稱(外文):Characterize the effect of different domain of slit2 C terminal on cell growth and invasion in CL1-5 lung cancer cell line
指導教授:蔡菁華
指導教授(外文):Jing-Hua T. Chang
學位類別:碩士
校院名稱:中山醫學大學
系所名稱:醫學分子毒理學研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:其他醫藥衛生學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2010
畢業學年度:98
語文別:中文
論文頁數:108
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Slit2是一個200 kDa分泌型醣蛋白,過去的研究著重於對神經軸突的遷徙上所扮演的抑制性角色。最近的發展顯示slit2扮演著抑癌基因的角色,具有抑制腫瘤的生長及侵襲的能力。另外,slit2對於血管新生亦有影響但意見較為分歧。在構築slit2 cDNA時,我們發現了exon15的剪接變異型的cDNA,具有exon15的slit2 (slit2-WT)會抑制CL1-5細胞的侵襲能力,而不具有exon15的slit2 (slit2-△E15)則不僅會抑制細胞的侵襲能力,並且會抑制細胞的生長。由於Slit2蛋白在神經細胞裡會被切割為140 kDa的Slit2-N terminal及55-60 kDa的Slit2-C terminal蛋白片段。我們發現Slit2-C terminal蛋白片段具有抑制細胞的生長及侵襲能力。因此我們構築了個別domain缺失的slit2 cDNA clone。結果發現缺失了EGF6-LamG domains的Slit2-△E15蛋白會失去抑制細胞生長及侵襲的能力。欲了解究竟EGF6-LamG domain是扮演著調控Slit2-△E15的生長及侵襲能力,還是這兩個domains本身即具有抑制生長及侵襲的能力,我們進一步表現不同domain的Slit2-C端的蛋白片段。我們發現LamG domain的C-terminal(LamG-C; a.a.(1228-1318))本身即具有抑制生長的能力但無抑制侵襲的能力,並推測LamG 的N-terminal(LamG-N; a.a. (1182-1227))區域則會影響slit2-△E15抑制細胞侵襲的能力,但目前我們還不能確認LamG-N本身是否具有抑制細胞侵襲的能力。因此我們將在EGF6 及LamG這兩個區域的範圍內構築更小的蛋白片段,以鑑定出具有抑制細胞生長及侵襲能力的最小片段,並進一步探討究竟是那些受體傳遞了slit2抑制細胞生長及侵犯的能力。

Slit2 is a 200 kDa secreted glycoprotein. Its role in axon repellent and cell migration were extensively studied in different systems. Recent studies pointed that slit2 possesses tumor suppressor activity by inhibition of tumor growth and invasion. We discovered different exon15 splicing isoforms during slit2 cDNA cloning. With exon 15, Slit2-WT inhibited cell invasion of CL1-5 lung cancer cells, while without exon15, Slit2-△E15 not only inhibited cell invasion but also inhibited cell growth. Previous studies showed that Slit2 can be cleaved into two fragments in neuron cells: a 140 kDa slit2-N terminal fragment; and a 55-60 kDa slit2-C terminal fragment. Previously, we discovered that slit2-C terminal protein can inhibit cell growth and cell invasion. To identify which domain(s) is/are involved in Slit-△E15-mediated growth and/or invasion inhibition activity, we deleted individual domain on slit2-△E15 cDNA. Our studies showed that Slit2-△E15 lacking EGF6-LamG domains lost the ability to inhibit cell growth and cell invasion. To clarify whether the EGF6-LamG domains play a modulation role in Slit2-△E15-mediated growth and invasion inhibition indirectly or these domains possess direct role in growth and/or invasion inhibition? We constructed and expressed individual domain of slit2-C terminal. We found that the C-terminal region of LamG domain (LamG-C; a.a.(1228-1318)) by itself possessed ability to inhibit cell growth but not cell invasion. Our results also suggested that the N-terminal of LamG domain (LamG-N; a.a. (1182-1227)) has an effect on slit2-△E15-mediated cell invasion, but we were unable to resolve whether LamG-N inhibits cell invasion by itself. Thus, we are currently narrow-down the peptide domain in EGF6 and LamG regions, and identify the minimum peptide domain(s) that has/have ability to inhibit cell growth and invasion. Furthermore, we will investigate the receptor(s) involved in slit2-mediated growth and invasion inhibition.

目錄
壹、 中文摘要 1
貳、 英文摘要 3
參、 縮寫表 5
肆、 前言 7
一、 肺癌 7
二、 鑑定參與肺癌形成的基因 10
三、 人類Slit2基因 11
3.1 Slit2的功能 12
3.2 Slit2與receptor的關係 13
3.3 本實驗室對Slit2功能的了解 14
3.4 Exon 15對Slit2功能的影響 15
3.5 Slit2-C端蛋白domain的介紹 16
3.6 Slit2-C端蛋白LamG domain的介紹 16
3.6.1 LamG domain與receptor的關係 17
3.7 Slit2-C端蛋白EGF domain的介紹 19
3.8 Slit2-C端蛋白CT domain的介紹 20
四、 研究動機 21
伍、 材料與儀器 22
一、 酵素 22
二、 商業套組 22
三、 試藥 22
四、 質體 23
五、 細胞株 23
六、 儀器 23
陸、 實驗方法 25
一、 質體DNA的萃取(Plasmid extract) 25
1.1 微量質體DNA萃取 25
1.2 中量質體萃取(QIAGEN Midi-Prep) 26
1.2.1 Invitrogen kit 26
1.2.2 Roche kit 27
二、 構築穩定表現基因 29
2.1 限制酶處理(Enzyme Digestion) 29
2.2 從電泳凝膠中純化DNA 29
2.3 利用CIP(Calf Intestinal)將載體酵素切位點去磷酸化 30
2.4 接合反應(Ligation) 31
2.5 利用化學法製備勝任細胞(Competent cell) 31
2.6 轉型作用(Transformation) 32
2.7 菌落聚合酵素連鎖反應(Colony Polymerase Chain Reaction) 33
2.8 自動定序的製備(Autosequence) 33
2.9 菌種保存 34
三、 肺癌細胞株培養 34
3.1 解凍細胞(Thaw cell cline) 34
3.2 肺癌細胞培養 35
3.3 細胞繼代 35
3.4 冷凍細胞(Frozen cell) 36
3.5 細胞轉殖作用(Transfection) 37
3.6 篩選抗G418的穩定表現細胞株(Slection of stable clone) 37
四、 西方墨點法(Western blot) 38
4.1 製備細胞均質液(Cell extract) 38
4.2 製備condition medium 39
4.3 蛋白定量分析 39
4.4 SDS PAGE的製備 40
4.5 SDS PAGE電泳操作及轉漬(Transfer blot) 40
4.6 抗體作用及偵測方法 41
五、 細胞計數生長試驗(Growth curve and Dobuling time) 42
六、 細胞侵襲試驗(Invasion assay) 44
七、 群落形成試驗(Colony formation or foci formation) 45
柒、 結果 46
一、 構築穩定表現Slit2-△LRR1、 -△LRR2、-△LRR3的載體 48
二、 構築穩定表現Slit2-△LRR4蛋白片段 48
三、 構築穩定表現Slit2-△EGF1-5蛋白片段 49
四、 構築穩定表現Slit2-△EGF6-LamG、-△EGF7-9蛋白片段 50
五、 構築穩定表現Slit2-△CT蛋白片段 51
六、 構築穩定表現Slit2-PEP3、PEP4、CT蛋白片段 51
七、 構築穩定表現Slit2-PEP4△CT蛋白片段 52
八、 篩選穩定表現Slit2蛋白片段的細胞株 52
九、 利用西方點墨法偵測穩定表現Slit2蛋白片段的細胞 52
(1) Slit2-△EGF6-LamG 53
(2) Slit2-△EGF7-9 53
(3) Slit2-PEP4△CT 53
(4) Slit2-CT 53
十、 利用細胞計數(Cell count assay)及細胞群落形成試驗(Colony formation assay)觀察過度表現Slit2-C端蛋白片段對於人類肺癌細胞株CL1-5 生長能力的影響 53
(1)Slit2-△EGF6-LamG對CL1-5細胞生長的影響 53
(2)Slit2-△EGF7-9對CL1-5細胞生長的影響 55
(3)Slit2-PEP4△CT對CL1-5細胞生長的影響 55
(4)Slit2-CT對CL1-5細胞生長的影響 56
十一、 利用細胞侵襲試驗(Cell invasion assay)觀察過度表現Slit2-C端蛋白片段對於人類肺癌細胞株CL1-5侵襲能力的影響 57
(1)Slit2-△EGF6-LamG對CL1-5細胞侵襲能力的影響 57
(2)Slit2-△EGF7-9對CL1-5細胞侵襲能力的影響 58
(3)Slit2-PEP4△CT對CL1-5細胞侵襲能力的影響 58
(4)Slit2-CT對CL1-5細胞侵襲能力的影響 59
捌、 討論 60
玖、 圖目錄 66
圖一、 全長Slit2基因所包含的domains及所構築的Slit2 constructs 66
圖二、 構築Slit2-△LRR1、-△LRR2、-△LRR3蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 68
圖三、 構築 Slit2-△LRR4蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 69
圖四、 構築 Slit2-△EGF1-5/6蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 70
圖五、 構築 Slit2-△EGF6-LamG、-△EGF7-9蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 71
圖六、 構築 Slit2-△CT蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 72
圖七、 構築 Slit2-PEP3、-PEP4、-CT蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 73
圖八、 構築 Slit2-PEP4△CT蛋白片段於 pcDNA載體的過程圖 74
圖九、 用西方點墨法偵測Slit2-△EGF6-LamG / CL1-5 stable clones中Slit2-△EGF6-LamG -myc融合蛋白(fusion protein)的表現量 75
圖十、 用西方點墨法偵測Slit2-△EGF7-9 / CL1-5 stable clones中Slit2-△EGF7-9 -myc融合蛋白(fusion protein)的表現量 76
圖十一、 利用西方點墨法偵測Slit2-PEP4△CT / CL1-5 stable clones中Slit2-CT-3X Flag融合蛋白(fusion protein)的表現量 77
圖十二、 利用西方點墨法偵測Slit2-CT / CL1-5 stable clones中Slit2-CT-3X Flag融合蛋白(fusion protein)的表現量 78
圖十三、 Slit2-△EGF6-LamG對 CL1-5細胞生長的影響 79
圖十四、 Slit2-△EGF7-9對 CL1-5細胞生長的影響 81
圖十五、 Slit2-PEP4△CT對 CL1-5細胞生長的影響 83
圖十六、 Slit2-CT對 CL1-5細胞生長的影響 85
圖十七、 Slit2-△EGF6-LamG對 CL1-5細胞侵襲能力之影響 87
圖十八、 Slit2-△EGF7-9對 CL1-5細胞侵襲能力之影響 88
圖十九、 Slit2-PEP4△CT對 CL1-5細胞侵襲能力之影響 89
圖二十、 Slit2- CT對 CL1-5細胞侵襲能力之影響 90
拾、 表目錄 92
表一、 引子序列 92
表二、 穩定表現的細胞 94
拾壹、 附圖 95
附圖一、 由Microarry所得Slit2基因在肺癌組織的相對表現量 95
附圖二、 由RT-realtime PCR定量Slit2基因在不同病人中,正常肺組織與肺腺癌組織中Slit2之差異表現量 96
附圖三、 由RT-realtime PCR定量Slit2基因在人類肺癌細胞株中的表現情形 97
附圖四、 Slit2基因所具之Exon15 alternate spice form 98
附圖五、 Slit蛋白之功能性單位 98
附圖六、 Laminins蛋白之結構圖 99
附圖七、 pcDNA3.1(-)/myc-His-A之map(Invitrogen) 100
附圖八、 yT&A vector之map(Yeastern) 101
附圖九、 p3XFLAG-myc-CMVTM-25 EXPRESSION VECTOR之map(SIGMA) 102
拾貳、 參考文獻 103

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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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