龜殼花 (Trimeresurus mucrosquamatus,TM) 為台灣的六大毒蛇之一，主要造成出血毒性，為咬傷率最高的蛇種之一。由於以龜殼花蛇毒之粗毒免疫馬匹後抗體效價不易提升，因此抗龜殼花蛇毒血清之製備不易，為探討此問題，本研究將龜殼花蛇毒應用陽離子交換樹脂層析法 (Ion exchange chromatography) 分離，利用溶血試驗及 ICR 小鼠毒力試驗，成功確認分離出龜殼花蛇毒之溶血及非溶血毒素蛋白，進而設計以粗毒、純化毒、先純化毒後粗毒及先粗毒後純化毒等四組不同免疫模式進行 ICR 小鼠之免疫，另馬匹以前三組之免疫模式進行免疫。為探討不同免疫模式所產生對抗龜殼花蛇毒蛋白抗體效價之影響，同時應用捕捉酵素連結免疫吸附法（capture enzyme-linked immunosorbent assay, C-ELISA）及抗龜殼花蛇毒蛋白之體外 (in vitro) 中和抗體試驗進行分析。IgY capture ELISA 分析結果顯示在小鼠及馬匹之試驗均以粗毒免疫及先純化毒後粗毒免疫之組別，其最終抗體效價反應較佳，另經先粗毒後純化毒免疫小鼠之抗體效價反應與粗毒免疫相似。利用兔血液培養基進行商品化抗龜殼花及赤尾鮐蛇毒血清、免疫ICR小鼠及馬匹後之抗龜殼花蛇毒血清中和龜殼花蛇毒溶血之能力試驗，於37℃反應9小時後其溶血圈直徑大小為0.2-0.3公分時，均為≧60田中單位，故本方法在8小時如沒有出現溶血圈，即代表該血清已初步符合產製，因此可作為引起溶血毒性之蛇毒免疫馬匹後之快速初步中和抗體效價篩選平台，以早期偵測不同馬匹之中和抗體效價。

Trimeresursus mucrosquamatus (TM) was one of six major vipers in Taiwan and it has hemorrhagic toxicity with highly biting rate among the six vipers. Due to the low neutralization titers of antivenin when immunized the horse with TM crude venom, which caused difficult manufacture of commercial TM antivenin. For investigate this, we firstly were separated the TM crude venom by ion exchange chromatography then used the hemolytic test and LD50 of ICR mice for identify the toxicity portions with hemolytic and non-hemolytic fractions (phospholipase A2, PLA2) . Secondly, we designed four immunized strategies to immunize ICR mice, which including: (A) TM crude venom, (B) toxicity portions of TM crude venom, (C) two vaccinations with toxicity portions of TM crude venom before TM crude venom, and (D) two vaccinations with TM crude venom before toxicity portions of TM crude venom and we also had immunized horse with (A) to (C) strategies. For understand the antibody titers to TM venom among different immunized strategies, we develop capture ELISA and in vitro neutralization antibody titer assay of TM crude venom to assay the antivenin of mice and horses. These results shown that A, C and D strategies have better antibody titers than B and the horses antivenin of in vivo neutralization antibody titers ≧ 60 Tanaka units (TU) neutralized TM crude venom were 0.2-0.3 cm hemolytic zone at 9 hrs, 37°C in rabbit blood agar. We conclude the TM crude venom could cause good antibody titer in mice and horse and the in vitro neutralization antibody titer assay could easy to preliminary screen the neutralization antibody titers of horse antivenin in this study.

摘要 I
Abstract II
目錄 III
圖目錄 VI
表目錄 VIII
第一章 前言 1
第二章 文獻回顧 2
一、台灣常見毒蛇之種類與分佈 2
二、毒蛇咬傷之鑑別與診斷 7
三、毒蛇咬傷之治療 8
四、龜殼花蛇毒之純化與主要毒素蛋白之特性 9
五、單株抗體 11
第三章 材料與方法 14
一、龜殼花蛇毒之製備 14
二、龜殼花蛇毒蛋白質之純化與聚丙烯醯胺膠體 (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 電泳分析 14

III
三、龜殼花蛇毒蛋白質之特性分析 17
四、龜殼花蛇毒蛋白質 Fraction IX 之分析 17
五、建立龜殼花蛇毒蛋白質抗原之動物免疫模式 23
六、應用酵素連結免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ) 檢測各免疫模式之抗體效價 24
七、抗龜殼花蛇毒血清之體外 (in vitro) 中和抗體試驗 28
第四章 結果與討論 31
一、龜殼花蛇毒蛋白質之純化與電泳分析 31
(ㄧ) 龜殼花蛇毒蛋白質之純化 31
(二) 龜殼花粗毒與純化毒之SDS-PAGE電泳分析 31
二、龜殼花蛇毒蛋白質之特性分析 31
(一) 以綿羊紅血球溶血試驗分析 fraction I 至 IX 造成溶血之能力 31
(二) ICR 小鼠毒力 32
三、龜殼花蛇毒蛋白質 Fraction IX 之純化與特性分析 32
(一) Fraction IX 之電泳分析及銀染 32
(二) 分子篩管柱分離 fraction IX 32
(三) ICR 小鼠毒力試驗檢測 fraction IXa 及 IXb 之毒力 32
IV
(四) Fraction IXb 之蛋白質身份鑑定 33
(五) 抗 PLA2單株抗體之製備 33
四、免疫策略對實驗動物血清中抗龜殼花蛇毒抗體產生之影響 33
(一) 以 IgY capture ELISA 進行抗龜殼花蛇毒抗體效價之分析 34
(二) 以 Mab capture ELISA 進行抗龜殼花蛇毒抗體效價之分析 37
(三) 以 IgY 或 Mab進行capture ELISA 之結果比較 38
五、抗龜殼花蛇毒血清之體外中和抗體試驗 39
參考文獻 41
附錄一 65
附錄二 66
附錄三 67
附錄四 68
附錄五 69
V
圖目錄
圖一、龜殼花蛇毒蛋白之陽離子交換樹脂層析圖譜 44
圖二、龜殼花蛇毒SDS-PAGE電泳圖 45
圖三、蛇毒蛋白之紅血球溶血試驗 46
圖四、龜殼花純化毒fraction IX之銀離子染色 47
圖五、Fraction IX 之凝膠過濾管柱層析圖譜 48
圖六、抗 PLA2 單株抗體之 western blot 分析 49
圖七、應用Western blotting 進行抗 crude、fraction VI+VII 及 PLA2 之IgY 專一性抗體分析 50
圖八、以 IgY capture ELISA 固定粗毒分析 ICR 小鼠血清中之抗體效價 51
圖九、以 IgY capture ELISA 固定粗毒分析馬匹血清中之抗體效價 52
圖十、以 Mab capture ELISA 固定粗毒分析馬匹血清中之抗PLA2 抗體效價 53
圖十一、以 Mab capture ELISA 固定粗毒分析不同田中單位馬匹血清中之抗PLA2抗體效價 54
圖十二、商品化血清與龜殼花蛇毒免疫後之ICR小鼠血清中和抗體效價分析 55
VI
圖十三、商品化血清中和龜殼花蛇毒後之溶血圈大小迴歸分析 56
圖十四、商品化血清與不同田中單位馬匹血清之體外中和抗體試驗比較 57
VII

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry 72, 248-254.
Ferreira, R.N., Machado de Avila, R.A., Sanchez, E.F., Maria, W.S., Molina, F., Granier, C. and Chavez-Olortegui, C. (2006) Antibodies against synthetic epitopes inhibit the enzymatic activity of mutalysin II, a metalloproteinase from bushmaster snake venom. Toxicon 48, 1098-1103.
Harlow, E. and Lane, D. (1988) Monoclonal antibodies. In Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA, pp. 139-244
Hung, C.C., Huang, K.F. and Chiou, S.H. (1994) Characterization of one novel venom protease with beta-fibrinogenase activity from the Taiwan habu (Trimeresurus mucrosquamatus): purification and cDNA sequence analysis. Biochemical and biophysical research communications 205, 1707-1715.
Hung, D.Z., Wu, T.C. and Deng, J.F. (1997) The painful experience of inappropriate therapy of snake bites: a report of two cases. Chinese medical journal 60, 326-330.
Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-497.
Matsui, T., Fujimura, Y. and Titani, K. (2000) Snake venom proteases affecting hemostasis and thrombosis. Biochimica et biophysica acta 1477, 146-156.
Miao, B.L., Liau, M.Y., Huang, R.J., Chen, S.W., Chen, T.K. and Chang, S.C. (1990) Preparation of toxoid from Taiwan cobra (Naja naja atra) venom. Chinese medical journal 46, 1-6.
Morine, N., Matsuda, S., Terada, K., Eto, A., Ishida, I. and Oku, H. (2008) Neutralization of hemorrhagic snake venom metalloproteinase HR1a from Protobothrops flavoviridis by human monoclonal antibody. Toxicon 51, 345-352.
Muramoto, K. and Kamiya, H. (1992) The amino-acid sequence of a lectin from conger eel, Conger myriaster, skin mucus. Biochimica et biophysica acta 1116, 129-136.
Russell FE. (1980) Snake venom poison in the United States. Annual Review of Medicine. 31, 247-259
Seto, M., Ogawa, T., Kodama, K., Muramoto, K., Kanayama, Y., Sakai, Y., Chijiwa, T. and Ohno, M. (2008) A novel recombinant system for functional expression of myonecrotic snake phospholipase A(2) in Escherichia coli using a new fusion affinity tag. Protein expression and purification 58, 194-202.
Sivaprasadarao, A. and Findlay, J.B. (1993) Expression of functional human retinol-binding protein in Escherichia coli using a secretion vector. The Biochemical journal 296 ( Pt 1), 209-215.
Tsai, I.H., Lu, P.J., Wang, Y.M., Ho, C.L. and Liaw, L.L. (1995) Molecular cloning and characterization of a neurotoxic phospholipase A2 from the venom of Taiwan habu (Trimeresurus mucrosquamatus). The Biochemical journal 311 ( Pt 3), 895-900.
Tsai, I.H. and Wang, Y.M. (1998) Effect of site directed mutagenesis on the activity of recombinant trimucrotoxin, a neurotoxic phospholipase from Trimeresurus mucrosquamatus venom. Toxicon 36, 1591-1597.
Waugh, D.S. (2005) Making the most of affinity tags. Trends in biotechnology 23, 316-320.

Wingert, W.A. and Wainschel, J. (1975) Diagnosis and management of envenomation by poisonous snakes. Southern medical journal 68, 1015-1026.
張之傑、蕭水銀、楊振忠 等人。(1984) 話蛇。學生科學叢書，正中書局印行，P14-15。
黃瑞禎，陳村光，廖明一 等人。(1986) 高效價出血性抗蛇毒血清之製備。中華醫誌，37, 410-415。
毛壽先、殷鳳儀。(1990) 台灣常見陸地蛇類簡介。台灣省立博物館。
廖明一。(1991) 台灣產毒蛇蛇毒類毒素及抗血清之研究。國立台灣大學獸醫學研究所博士論文。
陳發魁。(1999) 毒蛇咬傷在台灣。內科學誌，10, 49-57。
洪東榮。(2002) 台灣毒蛇咬傷的診斷治療及中毒機轉之研究。國立台灣大學毒理學研究所博士論文。
杜銘章。(2004) 蛇類大驚奇。遠流出版事業股份有限公司。