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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:李秀娟
研究生(外文):Li, Hsiu-Chuan
論文名稱:重組犬類濾泡刺激素之生產純化及活性分析
論文名稱(外文):Production, Purification and Functional Characterization of Recombinant Canine Follicle-stimulating Hormone
指導教授:張正張正引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立交通大學
系所名稱:生物科技系所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2009
畢業學年度:98
語文別:中文
論文頁數:85
中文關鍵詞:重組濾泡刺激素
外文關鍵詞:caninerecombinantFollicle-stimulating Hormone
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截至目前為止,雌犬的生育調控尚未完全明確。與一般動物比起來,犬隻的生殖生理有許多獨特的地方,這包括卵排出後到輸卵管等待精蟲授精,所排出的卵尚未成熟,直到配種的精蟲鑽入才會成熟,隨後再發育成受精卵,再到子宮懷孕;排卵前黃體(LH)高峰會促使卵巢細胞轉化而分泌助孕素(progesterone);助孕素可維持子宮穩定,使得以順利懷孕到分娩為止;懷孕與非懷孕雌犬體內的助孕素濃度極為相似等。而在內分泌系統中,濾泡刺激素(FSH)與目標細胞上的受體結合後,促使睪丸與卵巢發揮其功能,因此FSH對於哺乳動物的性徵與生殖生理扮演著極其重要的角色。
本研究的目的為試圖利用哺乳動物細胞表現系統,生產並純化重組的犬類濾泡刺激素(rcFSH)。首先將cFSHA 和cFSHB兩段cDNA,利用基因選殖技術選殖到哺乳動物的表現載體中,然後轉染到CHO與NS0細胞中表現。應用酵素免疫吸附及西方墨點法分析細胞內表現的重組犬類濾泡刺激素(rcFSH)。進一步與CHO細胞上表現的受體結合,利用酵素免疫分析(EIA)鑑定重組犬類濾泡刺激素在體外的生物活性,並與人類腦下垂體分離的濾泡刺激素做比較。實驗證明,此單鏈重組方法和細胞株所生產的犬類濾泡刺激素確實具有活性,可提供未來相關實驗與臨床利用。

中文摘要…………………………………………………………………I
英文摘要(Abstract)………………………………………………… II
目錄……………………………………………………………………III
表目錄…………………………………………………………………VII
圖目錄 ………………………………………………………………VIII

第一章 緒論
1-1犬隻的生殖 ………………………………………………………… 1
1-1-1 雌犬的生殖生理………………………………………………… 1
1-1-2 雌犬的發情週期………………………………………………… 2
1-2人類濾泡刺激素之生理意義…………………………………………3
1-2-1製造與分泌 ……………………………………………………… 3
1-2-2回饋調控(Feedback control)……………………………… 4
1-2-3對於女性的生理功能…………………………………………… 5
1-2-4對於男性的生理功……………………………………………… 5
1-3 結構特性與訊息傳遞……………………………………………… 5
1-3-1醣蛋白激素家族………………………………………………… 6
1-3-2 FSH結構與受體鍵结關係 ……………………………………… 6
1-3-3訊息傳遞 ………………………………………………………… 7
1-3-4醣基支鏈之組成 ………………………………………………… 8
1-4 研究動機與目的………………………………………………… 9

第二章 材料
2-1 菌株與細胞株 …………………………………………………… 11
2-2 培養基 …………………………………………………………… 11
2-3 人類濾泡刺激素受體cDNA ……………………………………… 12
2-4 轉殖載體 ………………………………………………………… 12
2-5 藥品試劑與緩衝液 ……………………………………………… 13
2-6 儀器 ……………………………………………………………… 17

第三章 方法
3-1 實驗前的資料搜尋及序列比對 ………………………………… 19
3-2 蛋白質同源模擬 ………………………………………………… 19
3-3 建構與選殖犬類濾泡刺激素rcFSH的菌種 ………………………20
3-3-1 聚合脢連鎖反應 (polymerase chain reaction ,PCR) … 20
3-3-1.1 PCR產物之純化 …………………………………………… 20
3-3-1.2 PCR產物瓊脂洋菜膠體電泳 (Agarose gel electrophoesis)……………………………………………………………………………20
3-3-1.3 PCR產物瓊脂洋菜膠體萃取 (Agarose gel extraction) ……………………………………………………………………………21
3-3-2 基因選殖 (cloning) ………………………………………… 23
● rcFSHA_pLIVE和reFSHB_pCpG 轉殖載體構築…………………… 23
3-3-2.1 限制脢酵素切割反應 ……………………………………… 23
3-3-2.2 接合反應 (Ligation) ………………………………………23
3-3-2.3 轉形反應 (Transformation)……………………………… 24
3-3-2.4 質體DNA之微量製備 (miniprep) ………………………… 24
● rcFSHAB_pLIVE 轉殖載體構築 ………………………………… 24
● rcFSHBA_pCpG 轉殖載體構築………………………………………25
● hFSHR_pSecTag2轉殖載體構築…………………………………… 26
3-4細胞培養 ………………………………………………………… 27
3-4-1細胞凍管保存 ………………………………………………… 27
3-4-2細胞解凍 ……………………………………………………… 28 3-5 細胞轉染 (Transfection) ………………………………………28
3-5-1 細胞轉染 (Effectene transfection) …………………… 28
3-5-2 細胞核轉染 (Nucleofection) …………………………… 29
3-5-3 抗生素篩選穩定表現細胞株 (Selection) ………………… 29
3-6蛋白質鑑定 …………………………………………………………29
3-6-1酵素免疫吸附分析 (ELISA) ………………………………… 29
3-6-2蛋白質電泳與染色 (SDS-PAGE)……………………………… 30
3-6-3蛋白質轉漬(protein transfer)………………………… 30
3-6-4西方墨點(western blotting……………………………… 30
3-6-5 ECL 免疫偵測(immunodetection)………………………… 31
3-7 分析基因重組犬類濾泡刺激素rcFSH在哺乳動物細胞中的蛋白質表現 …………………………………………………………………… 31
3-8 鑑定基因重組犬類濾泡刺激素rcFSH在細胞內的RNA現……… 31
3-8-1 RNA萃取 ……………………………………………………… 31
3-8-2 反轉錄脢-聚合連鎖反應 (RT-PCR) ………………………… 32
3-9基因重組犬類濾泡刺激素rcFSH之大量表現…………………… 33
3-10基因重組犬類濾泡刺激素rcFSH之蛋白純化…………………… 33
3-11蛋白質濃度測定 ………………………………………………… 34
3-12蛋白質膠內酵素水解 (In gel digestion) ……………………34
3-13基因重組人類濾泡刺激素受體rhFSHR在哺乳動物細胞中表現 ……………………………………………………………………………35
3-13-1細胞免疫螢光染色 (immuno-fluorescence staining) ……35
3-13-2流式細胞儀(flow cytometry) …………………………… 35
3-14生物活性測試 …………………………………………………… 35
第四章 結果
4-1犬類FSHA與FSHB mRNA序列 ……………………………………… 37
4-2犬類與人類FSHA/FSHB/FSHRHB胺基酸序列比對………………… 37
4-3放大rcFSHA and rcFSHB 基因片段……………………………… 37
4-4 rcFSHA_pLIVE and rcFSHB_pCpG表現載體之構築………………37
4-5 rcFSHAB/pLIVE表現載體之構築………………………………… 38
4-6 rcFSHA、rcFSHB及rcFSHAB在細胞的蛋白表現………………… 38
4-7 rcFSHA、rcFSHB及rcFSHAB在細胞內RNA的表現…………………38
4-8 rcFSHBA_pCpG表現載體之構築……………………………………39
4-9 rcFSHBA 在細胞的蛋白表現………………………………………39
4-10 rcFSHBA複合體的純化……………………………………………40
4-11 放大rhFSHR 的基因片段 ……………………………………… 40
4-12 rhFSHR_pSecTag2表現載體之構築………………………………40
4-13 rhFSHR在哺乳動物細胞的蛋白質表現………………………… 40
4-14 生物活性測試…………………………………………………… 41

第五章 討論…………………………………………………………… 42
第六章 參考文獻……………………………………………………… 46

1. Concannon, P. W. (1993) J Reprod Fertil Suppl 47, 3-27
2. Chakraborty, P. K., Panko, W. B., and Fletcher, W. S. (1980) Biol Reprod 22(2), 227-232
3. Concannon, P. W., Hansel, W., and Visek, W. J. (1975) Biol Reprod 13(1), 112-121
4. Concannon, P., Hansel, W., and McEntee, K. (1977) Biol Reprod 17(4), 604-613
5. Concannon, P. W. (1986) Vet Clin North Am Small Anim Pract 16(3), 453-475
6. Andersen, A. C. (1970b) Reproduction : The Beagle as an Experimental Animal
7. Evans, H. M. a. C., H.H. (1931) An introduction to the study of the oestrous cycle of the dog, Univ. of Calif. press, Berkeley.
8. Andersen, A. C. (1970a) Reproduction : The Beagle as an Experimental Animal
9. Bell, E. T. a. C., G.S. (1971) Br. Vet. J. 127, xxv-xxvii
10. Andersen, A. C. a. S., M.E. (1973) The Ovary and Reproductive Cycle of the Dog (Beagle)
11. Pierce, J. G., and Parsons, T. F. (1981) Annu Rev Biochem 50, 465-495
12. Richards, J. S., Ireland, J. J., Rao, M. C., Bernath, G. A., Midgley, A. R., Jr., and Reichert, L. E., Jr. (1976) Endocrinology 99(6), 1562-1570
13. Richards, J. S. (1980) Physiol Rev 60(1), 51-89
14. Means, A. R., Dedman, J. R., Tash, J. S., Tindall, D. J., van Sickle, M., and Welsh, M. J. (1980) Annu Rev Physiol 42, 59-70
15. Gharib, S. D., Wierman, M. E., Shupnik, M. A., and Chin, W. W. (1990) Endocr Rev 11(1), 177-199
16. Fiddes, J. C., and Goodman, H. M. (1979) Nature 281(5730), 351-356
17. Jameson, J. L., Becker, C. B., Lindell, C. M., and Habener, J. F. (1988) Mol Endocrinol 2(9), 806-815
18. Ulloa-Aguirre, A., and Timossi, C. (1998) Hum Reprod Update 4(3), 260-283
19. Fan, Q. R., and Hendrickson, W. A. (2005) Nature 433(7023), 269-277
20. Minegishi, T., Nakamura, K., Takakura, Y., Ibuki, Y., Igarashi, M., and Minegish, T. (1991) Biochem Biophys Res Commun 175(3), 1125-1130
21. Sohn, J., Ryu, K., Sievert, G., Jeoung, M., Ji, I., and Ji, T. H. (2002) J Biol Chem 277(51), 50165-50175
22. Walker, W. H., and Cheng, J. (2005) Reproduction 130(1), 15-28
23. Zirkin, B. R., Santulli, R., Awoniyi, C. A., and Ewing, L. L. (1989) Endocrinology 124(6), 3043-3049
24. Walker, W. H., Fucci, L., and Habener, J. F. (1995) Endocrinology 136(8), 3534-3545
25. Crepieux P., Marion S., Martinat N., Fafeur V., Vern Y.L., Kerboeuf D., Guillou F., and Reiter E. (2001) Oncogene. 20(34), 4696-4709
26. Cottom J, Salvador L.M, Maizels E.T, Reierstad S, Park Y, Carr D.W, Davare M.A, Hell J.W, Palmer S.S, Dent P, lawakatsu H, Ogata M, and Hunzicker-Dunn M. (2003) J. Biol. Chem. 278(9), 7167-7179
27. Maizels, E. T., Cottom, J., Jones, J. C., and Hunzicker-Dunn, M. (1998) Endocrinology 139(7), 3353-335644.
28. Nechman C.A, Thomas R.M, Cohen B.D, Acevedo G, Poulikakos P.I, Testa J.R, and Dias J.A. (2004) Biol. Reproduction 71, 629-636
29. Baenziger, J. U., and Green, E. D. (1988) Biochim Biophys Acta 947(2), 287-306
30. Keene, J.L., Nishimori, K., Galway, A.B., Matzuk, M.M., Hsueh, A.J.W., and Boime, I. (1994) Endocr. J 2, 175-179
31. Flack M.R., Froehlich J., Bennet A.P., Anasti J., and Nisula B.C. (1994) J Biol Chem 269(19), 14015-20
32. Bishop L.A., Robertson D.M., Cahir N., and Schofield P.R. (1994) Mol. Endocrinol. 8(6), 722-31.
33. Matzuk, M. M., Keene, J. L., and Boime, I. (1989) J Biol Chem 264(5), 2409-14
34. Lindau-Shepard B., Roth K.E., and Dias J.A. (1994) Endocrinology 135(3), 1235-40
35. Valove F.M., Finch C., Anasti J.., Froehlich J., and Flack M.R. (1994) Endocrinology 135(6), 2657-61
36. Dias J.A., Lindau-Shepard B., Hauer C., and Auger I. (1998) Biol. Reprod 58(6), 1331-6
37. Peng, P., Menoret, A., and Srivastava, P. K. (1997) J Immunol Methods 204(1), 13-21
38. Mayer, M., Kies, U., Kammermeier, R., and Buchner, J. (2000) J Biol Chem 275(38), 29421-29425
39. Keene, J. L., Matzuk, M. M., Otani, T., Fauser, B. C., Galway, A. B., Hsueh, A. J., and Boime, I. (1989) J Biol Chem 264(9), 4769-4775
40. Hakola, K., Van der Boogaart, P., Mulders, J., de Leeuw, R., Schoonen, W., Van Heyst, J., Swolfs, A., Van Casteren, J., Huhtaniemi, I., and Kloosterboer, H. (1997) Mol Cell Endocrinol 127(1), 59-69
41. Hard, K., Mekking, A., Damm, J.B.L., Kamerling, J.P., De Boer, W., Wijnands, R.A. and Vliegenthart, J.F.G. (1990) FEBS, 263-271
42. Matzuk, M.M., Krieger, M., Corless, C.L. and Boime, I. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(18), 6354–6358
43. Matzuk, M.M., Kornmeier, C.M., Whitfield, G.K., Kourides, I.A. and Boime, I. (1988) Mol. Endocrinol. 2(2), 95–99
44. Kaetzel, D.M. and Nilsson, J.H. (1988) J. Biol. Chem. 263(13), 6344–6351.
45. Smith, P.L., Kaetzel, D., Nilson, J. and Baenziger, J.U. (1990) J. Biol. Chem. 265(2), 874–881
46. Kwiatkowska, E.P., Kazimierczak, U., Mackiewicz, A. and Kowalczyk, D.W. (2006) Acta Biochim Pol. 53(2),361-9
47. Till Ku, S.C., Ng, D.T., Yap, M.G. and Chao, S.H. ( 2008) Biotechnol Bioeng. 99(1),155-64
48. Mulder, J.E., Schneyer, A.L., Taylor, A.E., Crowley, W.F. Jr. and Sluss, P.M. (2008) FESEB.
49. Baker, K.N., Rendall, M.H., Hills, A.E., Hoare, M., Freedman, R.B. and James, D.C.(2001) Biotechnol Bioeng. 73(3), 188-202
50. Yoshida, M., Aizawa, T., Nakamura, T., Shitara, K., Hayakawa, Y., Matsubara, K., Miura, K., Kouno, T., Clark, K.D., Strand, M.R., Mizuguchi, M., Demura, M., Nitta, K., and Kawano, K. (2004) J. Biol. Chem. 279(49):51331-7
51. Choi, J. H., Choi, K. C., Auersperg, N., and Leung, P. C. (2004) J Clin Endocrinol Metab 89(11), 5508-5516
52. Tilly, J.L., Aihara, T., Nishimori, K., Jia, X.-C., Billig, H., Kowalski, K.I., Perlas, E.A. and Hsueh, A.J.W. (1992) Endocrinology 131(2), 799–806
53. Mulder, J.E., Schneyer, A.L., Taylor, A.E., Crowley, W.F. Jr. and Sluss, P.M. (1994) Endocr. J. 2, 25–31
54. Lee, H. S., Seo, Y. I., Yin, X. J., Cho, S. G., Lee, S. S., Kim, N. H., Cho, S. K., and Kong, I. K. (2007) Reprod Domest Anim 42(6), 561-565
55. Chaubal, S. A., Ferre, L. B., Molina, J. A., Faber, D. C., Bols, P. E., Rezamand, P., Tian, X., and Yang, X. (2007) Theriogenology 67(4), 719-728
56. Jennings, M. W., Boime, I., Daphna-Iken, D., Jablonka-Shariff, A., Conley, A. J., Colgin, M., Bidstrup, L. A., Meyers-Brown, G. A., Famula, T. R., and Roser, J. F. (2009) Anim Reprod Sci 116(3-4), 291-307
57. 黃琮道 (2005) 去醣基人類濾泡刺激素之菌體表現及其對於卵巢癌細胞增生影響之研究. 國立交通大學生物科技學系碩士論文
58. canine estrous cycle http://www.vetmed.lsu.edu/eiltslotus/Theriogenology-5361/the_normal_canine.htm

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