臺灣博碩士論文加值系統

本研究主要在探討以LC-MS/MS分析水產品中三苯甲烷類化合物，分別以固、液相萃取方式，探討在不同水產品中，其基質效應、操作時間、成本及有機溶劑使用量的差異，並依照歐盟法規2002/657/EC所要求的指標來進行方法確效。液相層析系統是利用0.5 mM 醋酸銨水溶液（以醋酸調整為 pH 3.8）以及添加 0.1%甲酸的氰甲烷來進行梯度沖提，層析管柱為C18的逆相管柱，質譜儀偵測部分用的是陽離子選擇模式。
方法確效方面，每各化合物的(標準偏差/平均滯留時間)都小於0.05，而離子比也都維持在穩定的狀態且都符合歐盟規範，檢量線斜率相關係數介於 0.998 ~ 0.999。CCα(decision limit,判定極限值)，孔雀綠為0.09 ± 0.05 μgkg-1，還原型孔雀綠為 0.19 ± 0.14 μgkg-1，結晶紫為0.15 ± 0.13 μgkg-1，還原型結晶紫為0.15 ± 0.10 μgkg-1；CCβ(detection capability,偵測能力值)，孔雀綠為0.11 ± 0.06 μgkg-1，還原型孔雀綠為0.23 ± 0.17 μgkg-1，結晶紫為0.19 ± 0.16 μgkg-1，還原型結晶紫為0.18 ± 0.13 μgkg-1。
實驗結果顯示，在基質效應上固相萃取和液相萃取並無顯著差異；而液相萃取在操作時間、成本比較及使用有機溶劑量上比固相萃取省時、較低成本及較少有機溶劑量使用。

This research investigate the matrix effect, operation time, cost and solvent comsumption for triarylmethanes and corresponding metabolites in different aquaculture products by different extraction methods. Triarylmethane was determined by LC-ESI-MS/MS in positive mode. The analytical method validation were followed the regulation of 2002/657/EC. HPLC separation was conducted with the RP-18 column. The mobile phases consisted of 0.5 mM ammonium acetate buffer (pH 3.8, adjusted with acetic acid) – acetonitrile (contained 0.1% formic acid) solution.
The ratios of standard deviation to average residual time for all compounds are less than 0.05. The ion ratio is stable and allowed by the regulation of 2002/657/EC. The regression constant of calibration curve is in the range from 0.998 to 0.999. The CCα for MG, LMG, CV, LCV are 0.09 ± 0.05, 0.19 ± 0.14, 0.15 ± 0.13, 0.15 ± 0.10 μgkg-1, respectively. The CCβ for MG, LMG, CV, LCV are 0.09 ± 0.05, 0.19 ± 0.14, 0.15 ± 0.13, 0.15 ±0.10 μgkg-1, respectively.
The results for SPE and liquid-liquid extraction are not significantly different; the liquid-liquid extraction have shorter operation time, cheaper cost and less solvent consumption in comparison with SPE.

中文摘要……………………...………………………………………………...i
Abstract..…………...…………………………………..………………………ii
誌謝……………...……………………………………….……………………iii
目錄…………...……………………………………….………………………iv
表目錄……...……………………………………….…………………………vi
圖目錄…...………………………………….…………………………………ix

壹. 前言...........………………………………………………………………… 1
一. 孔雀綠及還原型孔雀綠.......…………………………………………1
二. 結晶紫及還原型結晶紫…...…………………………………………5
三. 三苯甲烷類分析方法…………...……………………………………7
四. 研究目的…….……..…………………………………………………8

貳. 實驗材料及方法……………………………………………………………9
一. 藥品及試劑製備……..……………………………………………… 9
二. 實驗器材與儀器設備.........................................................................14
三. 分析方法……………………………………………………….……15
四. 固相萃取之方法確效……………………………………….………19

參. 結果與討論..………………………………………………………………27
一. LC-MS/MS…..………………………………………………………27
二. 方法確效.....…………………………………………………………32
三. 固液相萃取比較…………………………………………………… 47

肆. 結論..………………………………………………………………………53

伍. 參考文獻..…………………………………………………………………55

陸. 附錄…..……………………………………………………………………59
附錄一. CCα與CCβ計算...…………………….………………………59
附錄二. 方法確效的十五組數據……...……….………………………63
附錄三. 試藥樣品的穩定性數據……………....………………………67

表目錄
表1. HPLC操作條件……………..……………..……………………………18
表2. HPLC移動相的設定…………..…………..……………………………18
表3. 檢測有機藥物殘留與污染物之最適檢測法一覽表（2002/657/EC,
2002）…….……………………………………………………………20
表4. 質譜儀種類與其偵測模式對應Identification points（IPs）之關
係表（2002/657/EC, 2002）……………………...……………………21
表5. 離子比容許值（2002/657/EC, 2002）…………..………………………24
表6. 真值的規範範圍（2002/657/EC, 2002）……………..…………………24
表7. 精密度中CV(%)的規範要求 （2002/657/EC, 2002）…………………24
表8. 試藥樣品四種不同環境的設計與編號………………….……………26
表9. 孔雀綠、還原型孔雀綠、結晶紫、還原型結晶紫檢測時的MS參數
設定…………………………………………………….………………31

表 10. 孔雀綠、還原型孔雀綠、結晶紫、還原型結晶紫之定性、定量離子
、滯留時間和離子比 …....…………………………..………………33
表 11. 孔雀綠、還原型孔雀綠、結晶紫與還原型結晶紫檢量線相關係數
……………………………………………………………………35
表 12. 孔雀綠的十五組數據的平均值、標準偏差、CV(%)與回收率…..…35


表13. 還原型孔雀綠的十五組數據的平均值、標準偏差、CV(%)與回收率
………………………………………………………………………35
表14. 結晶紫的十五組數據的平均值、標準偏差、CV(%)與回收率………36
表15. 還原型結晶紫的十五組數據的平均值、標準偏差、CV(%)與回收率
………………………………………………………………………36
表16. 孔雀綠精密度實驗（n=3）的平均值、標準偏差、CV(%)……….……38
表17. 還原型孔雀綠精密度實驗（n=3）的平均值、標準偏差、CV(%)….…39
表18. 結晶紫精密度實驗（n=3）的平均值、標準偏差、CV(%)…….………40
表19. 還原型結晶紫精密度實驗（n=3）的平均值、標準偏差、CV(%)….…41
表20. 孔雀綠、還原型孔雀綠、結晶紫與還原型結晶紫的CCα與CCβ…...44
表21. 固液相萃取比較-吳郭魚的萃取率…………..………………………48
表22. 固液相萃取比較-虱目魚的萃取率……..……………………………48
表23. 固液相萃取比較-浦燒鰻的萃取率………..…………………………49
表24. 固液相萃取比較-白燒鰻的萃取率……..……………………………49
表25. 固液相萃取比較-金目鱸的萃取率……..……………………………50
表26. 固液相萃取比較-文蛤的萃取率………..……………………………50
表27. 固液相萃取比較-土虱的萃取率………..……………………………51
附表1-1. 範例各點儀器偵測濃度(Xi)與積分面積(Yi)….…………………61
附表1-2. 計算式中各代號定義…………….……………….………………61
附表2-1. 孔雀綠方法確效的十五組數據……………………..……………63
附表2-2. 還原型孔雀綠方法確效的十五組數據………..…………………64
附表2-3. 結晶紫方法確效的十五組數據………………..…………………65
附表2-4. 還原型結晶紫方法確效的十五組數據…………………..………66
附表3-1. 穩定性-孔雀綠-E1的數據………………………………..………67
附表3-2. 穩定性-孔雀綠-E2的數據…………………………….……… …68
附表3-3. 穩定性-孔雀綠-E3的數據……………………..…………………69
附表3-4. 穩定性-孔雀綠-E4的數據………………………………..………70
附表3-5. 穩定性-還原型孔雀綠-E1的數據……………..…………………71
附表3-6. 穩定性-還原型孔雀綠-E2的數據………………..………………72
附表3-7. 穩定性-還原型孔雀綠-E3的數據……………………..…………73
附表3-8. 穩定性-還原型孔雀綠-E4的數據…………………..……………74
附表3-9. 穩定性-結晶紫-E1的數據……………………………..…………75
附表3-10. 穩定性-結晶紫-E2的數據………………………………………76
附表3-11. 穩定性-結晶紫-E3的數據………………………….……………77
附表3-12. 穩定性-結晶紫-E4的數據………………………………………78
附表3-13. 穩定性-還原型結晶紫-E1的數據………………………………79
附表3-14. 穩定性-還原型結晶紫-E2的數據………………………………80
附表3-15. 穩定性-還原型結晶紫-E3的數據………………………………81
附表3-16. 穩定性-還原型結晶紫-E4的數據………………………………82
圖目錄
圖1. 孔雀綠(MG)與其主要代謝物還原型孔雀綠(LMG) ……………..……3
圖2. 結晶紫(CV)與其主要代謝物還原型結晶紫(LCV) ……….……..……6
圖3. 孔雀綠之HPLC-MS/MS層析圖譜……………………………………28
圖4. 還原型孔雀綠之HPLC-MS/MS層析圖譜……………………………28
圖5. 結晶紫之HPLC-MS/MS層析圖譜……………………………………29
圖6. 還原型結晶紫之HPLC-MS/MS層析圖譜……………………………29圖7. 孔雀綠與還原型孔雀綠內部標準品之HPLC-MS/MS層析圖譜........30
圖8. 穩定性實驗-孔雀綠……………………………………………………44
圖9. 穩定性實驗-還原型孔雀綠……………………………………………45
圖10.穩定性實驗-結晶紫……………………………………………………45
圖11.穩定性實驗-還原型結晶紫…………………………...…………….…46
附圖1-1. Yc、Yd與CCα、CCβ關係圖..………………………………….……62

行政院衛生署 食品藥物管理局http://www.fda.gov.tw

食品中動物用藥殘留量檢驗方法 – 孔雀綠及其代謝物之檢驗草案(Draft method of test for veterinary drug residues in foods – test of malachite green and its metabolite) 行政院衛生署97年1月11日署授食字第0971800008號公告。

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