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研究生:張至睿
研究生(外文):Chih-Jui Chang
論文名稱:虎奶菇菌體外多醣體誘導大腸癌細胞SW620細胞凋亡之抗癌特性
論文名稱(外文):Potential anticancer properties of the polysaccharides of Pleurotus tuber-regium by induction of apoptosis in SW620 cells
指導教授:蔡英傑蔡英傑引用關係
指導教授(外文):Ying-Chieh Tsai
學位類別:碩士
校院名稱:國立陽明大學
系所名稱:生化暨分子生物研究所
學門:生命科學學門
學類:生物化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2010
畢業學年度:98
語文別:中文
論文頁數:64
中文關鍵詞:大腸癌細胞多醣虎奶菇細胞凋亡
外文關鍵詞:SW620polysaccharidepleurotus tuber-regiumapoptosismushroomcancer
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癌症長年以來一直為國人死亡率第一名,如何有效的預防及治療癌症為當今醫學上首要的課題。經過多年的研究,大多數菇類多醣體已被證實具有抗癌的特性,而我所研究的虎奶菇是一種食用藥用兼具的菇類,其菌核多醣體已被證實具有抑制腫瘤的能力,但其菌體外多醣體至今卻尚未有任何研究發表。我發現虎奶菇菌體外多醣體能夠有效地殺死SW620大腸癌細胞,IC50為712μg/mL,而且對正常的角質細胞HaCaT及胚胎肝細胞CL48不會產生毒性,進一步利用細胞型態觀察、流式細胞儀分析sub-G1 phase及DNA fragmentation assay證明細胞走向細胞凋亡路徑而非細胞壞死路徑,並利用西方點墨法發現細胞是透過活化起始蛋白caspase-8、caspase-9以及下游的執行蛋白caspase-3來促使細胞走向細胞凋亡。此外,MAPKs路徑也發現多醣體會使ERK的活性降低、p38活性升高,均促使細胞走向細胞凋亡。綜合以上結果,虎奶菇菌體外多醣體是透過活化caspase路徑及調控MAPKs路徑誘導SW620走向細胞凋亡。
The cancer mortality has been the first of the people death for years. The most important topic is how to prevent and cure the cancer disease. Most mushroom polysaccharides, for many years, had been demonstrated that they possess the anti-cancer activities. Pleutotus tuber-regium is a well known as a traditional medicinal and edible mushroom. The mixtures of polysaccharides isolated from sclerotia of Pleutotus tuber-regium show anti-tumor properties. However, there was little known about the biological activities of extracellular polysaccharides of Pleutotus tuber-regium. In this study, I demonstrate that the apoptosis induced by extracellular polysaccharides isolated from Pleutotus tuber-regium(PTREPS) on SW620 human colon cancer cell line and the IC50 is 711μg/mL. Furthermore, there is no any cytotoxic effect on HaCaT cell (human normal keratinocyte) and CL-48(human embryonic liver cell) cell. By the ways of observing cell morphological change、flow cytometry analysis and DNA fragmentation assay lead to evidence that cell death by exposure to PTREPS is through apoptosis, not necrosis.
Mechanistically, PTREPS are found to induce apoptosis on SW620 cell by activation of caspase-8、caspase-9 and its downstream caspase-3. In addition, the PTRESP treatment as well as increase the activation of p38 and decrease the activation of ERK. The results indicate the PTRESP-induced apoptosis may related to the activation of caspase pathway and regulation MAPKs pathway.

目錄…………………………………………………...………………I~V
中文摘要…………………………………………………….………… 1
英文摘要…………………………………………………….………… 2
第一章 緒論……………………………………………………………3
第一節 癌症…………………………………………………………3
一、 癌症簡介……………………………………………………3
二、 癌症成因……………………………………………………3
三、 致癌基因……………………………………………………4
四、 癌症形成……………………………………………………5
五、 癌細胞特性…………………………………………………5
第二節 大腸癌………………………………………………………6
一、 大腸癌簡介…………………………………………………6
二、 大腸癌病因與症狀…………………………………………7
三、 診斷及治療…………………………………………………8
四、 大腸癌分期…………………………………………………9
第二節細胞凋亡…………………………………….…………….…10
一、 細胞凋亡簡介………………………………………………10
二、 細胞凋亡路徑………………………………………………11
第三節Mitogen-activated protein kinases…………………………11
一、 MAPKs簡介………………………………………………11
二、 ERK…………………………………………..……………12
三、 JNK…………………………………………………………12
四、 p38…………………………………………………………13
第二節 菇類與多醣體………………………………………………13
一、 菇類與多醣體簡介………………………………..………13
二、 多醣體萃取與結構………………………………..………14
三、 多醣體抗癌機制………………………………..…………15
四、 虎奶菇……………………………………………..………16
第四節 研究動機…………………………………………..………17
第五節 實驗設計…………………………………………..………17
第二章 實驗材料與方法……………………………………..………19
第一節 實驗材料………………………………………..…………19
一、 虎奶菇………………………………………….….………19
二、 細胞株……………………………………….….…………19
三、 實驗藥品…………………………………….……….……19
四、 儀器設備……………………………………..……………21
五、 藥品配製……………………………………..……………22
第二節 實驗方法………………………………………..…………23
一、 多醣體萃取及配製……………………………..…………23
二、 總醣測定………………………………………..…………23
三、 冷凍細胞之活化…………………………..………………24
四、 細胞冷凍保存……………………………..………………24
五、 細胞培養……………………………………..……………24
六、 MTT assay…………………………………………………25
七、 細胞型態觀察………………………………..……………25
八、 流式細胞儀分析Sub-G1 phase……………………………25
九、 DNA fragmentation assay…………………………………26
十、 西方點墨法…………………………………………………26
第三章 實驗結果……………………………………..………………29
一、 虎奶菇菌體外多醣體萃取…………………..………………29
二、 虎奶菇菌體外多醣體之細胞毒性篩選癌細胞株………..…29
三、 虎奶菇菌體外多醣體對SW620 cell細胞型態之影響……29
四、 流式細胞儀分析sub-G1 phase…………………..…………30
五、 DNA斷裂分析………………………………………………30
六、 西方點墨法探討多醣體對caspase表現的影響……...……30
七、 虎奶菇菌體外多醣體對MAPKs活性的影響…………..…31
第四章 討論…………………………………………………..………32
一、 虎奶菇菌體外多醣體萃取…………………………..………32
二、 抗癌特性之細胞株篩選…………………………………..…33
三、 虎奶菇菌體外多醣體誘使SW620細胞走向細胞凋亡……33
四、 虎奶菇菌體外多醣體對於MAPKs活性影響………..……34
五、 各種多醣體抗癌活性比較…………………………………..34
六、 未來與展望………………………………….. ………………35
第五章 參考文獻……………………………………………..………37
第六章 附圖表與實驗結果圖………………………………..………45
附圖(一) 細胞凋亡特性………………………………..…..……45
附圖(二) 細胞凋亡路徑………………………………..…..……46
附圖(三) MAPKs訊號傳遞路…………………………..…..….…46
附圖(四) 各類多醣體構型……………………………..…..……47
附圖(五) 虎奶菇………………………………………..…..……48
附圖(六) 虎奶菇菌體外多醣體萃取流程……………..…..……49
附表(一) 虎奶菇菌體外多醣體萃取結果………………………50
附表(二) 各種菇類多醣體與活性………………………….……51
圖(一) 虎奶菇菌體外多醣體對Hela細胞存活率影響…..……54
圖(二) 虎奶菇菌體外多醣體對A549細胞存活率影響…….…54
圖(三) 虎奶菇菌體外多醣體對Hep G2細胞存活率影響….…55
圖(四) 虎奶菇菌體外多醣體對MCF-7細胞存活率影響….…55
圖(五) 虎奶菇菌體外多醣體對HT-29細胞存活率影響………56
圖(六) 虎奶菇菌體外多醣體對SW480細胞存活率影響………56
圖(七) 虎奶菇菌體外多醣體對SW60細胞存活率影響………57
圖(八) 虎奶菇菌體外多醣體對CL48細胞存活率影響…….…57
圖 (九) 虎奶菇菌體外多醣體對HaCaT細胞存活率影響………58
圖(十) 虎奶菇菌體外多醣體對SW620細胞型態影響…..……59
圖(十一) 流式細胞儀分析sub-G1 phase………………………60
圖(十二) DNA fragmentation assay………………………….…61
圖(十二)西方點墨法分析caspase蛋白表現……………………62
圖(十三)西方點墨法分析MAPKs蛋白表現…………..………63

目錄…………………………………………………...………………I~V
中文摘要…………………………………………………….………… 1
英文摘要…………………………………………………….………… 2
第一章 緒論……………………………………………………………3
第一節 癌症…………………………………………………………3
一、 癌症簡介……………………………………………………3
二、 癌症成因……………………………………………………3
三、 致癌基因……………………………………………………4
四、 癌症形成……………………………………………………5
五、 癌細胞特性…………………………………………………5
第二節 大腸癌………………………………………………………6
一、 大腸癌簡介…………………………………………………6
二、 大腸癌病因與症狀…………………………………………7
三、 診斷及治療…………………………………………………8
四、 大腸癌分期…………………………………………………9
第二節細胞凋亡…………………………………….…………….…10
一、 細胞凋亡簡介………………………………………………10
二、 細胞凋亡路徑………………………………………………11
第三節Mitogen-activated protein kinases…………………………11
一、 MAPKs簡介………………………………………………11
二、 ERK…………………………………………..……………12
三、 JNK…………………………………………………………12
四、 p38…………………………………………………………13
第二節 菇類與多醣體………………………………………………13
一、 菇類與多醣體簡介………………………………..………13
二、 多醣體萃取與結構………………………………..………14
三、 多醣體抗癌機制………………………………..…………15
四、 虎奶菇……………………………………………..………16
第四節 研究動機…………………………………………..………17
第五節 實驗設計…………………………………………..………17
第二章 實驗材料與方法……………………………………..………19
第一節 實驗材料………………………………………..…………19
一、 虎奶菇………………………………………….….………19
二、 細胞株……………………………………….….…………19
三、 實驗藥品…………………………………….……….……19
四、 儀器設備……………………………………..……………21
五、 藥品配製……………………………………..……………22
第二節 實驗方法………………………………………..…………23
一、 多醣體萃取及配製……………………………..…………23
二、 總醣測定………………………………………..…………23
三、 冷凍細胞之活化…………………………..………………24
四、 細胞冷凍保存……………………………..………………24
五、 細胞培養……………………………………..……………24
六、 MTT assay…………………………………………………25
七、 細胞型態觀察………………………………..……………25
八、 流式細胞儀分析Sub-G1 phase……………………………25
九、 DNA fragmentation assay…………………………………26
十、 西方點墨法…………………………………………………26
第三章 實驗結果……………………………………..………………29
一、 虎奶菇菌體外多醣體萃取…………………..………………29
二、 虎奶菇菌體外多醣體之細胞毒性篩選癌細胞株………..…29
三、 虎奶菇菌體外多醣體對SW620 cell細胞型態之影響……29
四、 流式細胞儀分析sub-G1 phase…………………..…………30
五、 DNA斷裂分析………………………………………………30
六、 西方點墨法探討多醣體對caspase表現的影響……...……30
七、 虎奶菇菌體外多醣體對MAPKs活性的影響…………..…31
第四章 討論…………………………………………………..………32
一、 虎奶菇菌體外多醣體萃取…………………………..………32
二、 抗癌特性之細胞株篩選…………………………………..…33
三、 虎奶菇菌體外多醣體誘使SW620細胞走向細胞凋亡……33
四、 虎奶菇菌體外多醣體對於MAPKs活性影響………..……34
五、 各種多醣體抗癌活性比較…………………………………..34
六、 未來與展望………………………………….. ………………35
第五章 參考文獻……………………………………………..………37
第六章 附圖表與實驗結果圖………………………………..………45
附圖(一) 細胞凋亡特性………………………………..…..……45
附圖(二) 細胞凋亡路徑………………………………..…..……46
附圖(三) MAPKs訊號傳遞路…………………………..…..….…46
附圖(四) 各類多醣體構型……………………………..…..……47
附圖(五) 虎奶菇………………………………………..…..……48
附圖(六) 虎奶菇菌體外多醣體萃取流程……………..…..……49
附表(一) 虎奶菇菌體外多醣體萃取結果………………………50
附表(二) 各種菇類多醣體與活性………………………….……51
圖(一) 虎奶菇菌體外多醣體對Hela細胞存活率影響…..……54
圖(二) 虎奶菇菌體外多醣體對A549細胞存活率影響…….…54
圖(三) 虎奶菇菌體外多醣體對Hep G2細胞存活率影響….…55
圖(四) 虎奶菇菌體外多醣體對MCF-7細胞存活率影響….…55
圖(五) 虎奶菇菌體外多醣體對HT-29細胞存活率影響………56
圖(六) 虎奶菇菌體外多醣體對SW480細胞存活率影響………56
圖(七) 虎奶菇菌體外多醣體對SW60細胞存活率影響………57
圖(八) 虎奶菇菌體外多醣體對CL48細胞存活率影響…….…57
圖 (九) 虎奶菇菌體外多醣體對HaCaT細胞存活率影響………58
圖(十) 虎奶菇菌體外多醣體對SW620細胞型態影響…..……59
圖(十一) 流式細胞儀分析sub-G1 phase………………………60
圖(十二) DNA fragmentation assay………………………….…61
圖(十二)西方點墨法分析caspase蛋白表現……………………62
圖(十三)西方點墨法分析MAPKs蛋白表現…………..………63

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