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研究生:吳昭慶
研究生(外文):Wu, Chao-Ching
論文名稱:光波導式粒子電漿共振生化感測器對生物分子間交互作用動力學之研究
論文名稱(外文):Using optical waveguide-based particle plasmon resonance biosensor for quantitative measurement of biomolecular interaction kinetics
指導教授:周禮君周禮君引用關係
指導教授(外文):Chau, Lai-Kwan
口試委員:周禮君王少君謝文馨
口試委員(外文):Chau, Lai-KwanWang, Shau-ChunHsieh, Wen-Hsin
口試日期:2011-06-21
學位類別:碩士
校院名稱:國立中正大學
系所名稱:化學暨生物化學研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2011
畢業學年度:99
語文別:中文
論文頁數:103
中文關鍵詞:金奈米粒子粒子電漿共振平面光波導粒子電漿共振感測器光纖式粒子電漿共振感測器卵蛋白老鼠免疫球蛋白分子結合動力學
外文關鍵詞:gold nanoparticlesparticle plasmon resonanceplanar waveguide, gratingfiber-optic particle plasmon resonance biosensorovalbuminmouse IgGbinding kinetics
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本研究為使用自行開發的光波導生化感測器作為生物分子間的交互作用動力學研究。第一種晶片為將光柵利用UV膠壓印在已修飾金奈米粒子的玻璃片上,槽道區在玻璃片的另一側且波導層為玻璃片,簡稱為奈米粒子-光柵異側型晶片。第二種則是利用光柵壓印在已塗佈在玻璃片上的光聚合溶膠凝膠材料,接著再修飾上金奈米粒子,光柵與槽道區為同側且波導層為光聚合溶膠凝膠材料,簡稱為奈米粒子-光柵同側型晶片。感測原理是藉由波長532nm的綠光雷射作為光源,當雷射光入射波導層之後,觀察反射出來光點的位置變化量來達到檢測的目的。將兩種晶片去檢測不同環境折射率溶液可以得到感測檢析度分別為2.8×10-5 RIU與1.1×10-4 RIU;檢測anti-DNP則可以得到偵測極限分別為1.4×10-11 M和5.4×10-10 M。進一步對觀察到的生物分子結合動力學曲線探討,發現其系統的訊號品質不佳以至於無法準確計算動力學常數。
由於平面光波導感測器有上述的問題,因此選擇另一套光纖式粒子電漿共振(FOPPR)生化感測器作為生物分子間交互作用的動力學研究。此生化感測器是利用在已修飾金奈米粒子的光纖基材表面再修飾上自組裝單層膜,以達到用卵蛋白(OVA)去檢測其抗體(anti-OVA)和驗證動力學常數計算公式的可行性之目的。在這個即時偵測的檢測過程中,anti-OVA直接與已固定在光纖基材表面的OVA進行結合反應,最後可以得到其偵測極限為2.4×10-9 M。藉由假設Langmuir型的吸附模型,可以推導出實驗中生物分子間的動力學常數,其中包括結合速率常數(ka)和分解速率常數(kd)。在OVA對anti-OVA的檢測中可以得到ka為(5.5±2.5)×103 M-1s-1;kd為(3.5±1.6)×10-4 s-1。為了證明此實驗的正確性,又選擇一組生物分子(老鼠免疫球蛋白/山羊老鼠免疫球蛋白抗體)作為驗證,依然可以得到其動力學常數ka為(1.9±0.6)×106 M-1s-1; kd為(1.7±0.6)×10-2 s-1。因此可以證明FOPPR生化感測器可以成功地觀察生物分子間的結合動力學並計算出動力學常數。
另外我們也利用再生溶液去進行再生反應的實驗,由相當不錯的再現性結果可以得知此感測晶片具有很好的重複使用性,另外也證明晶片上的辨識分子有不錯的穩定性。
Measuring the kinetic constants of antigen-antibody interactions becomes critical in characterizing specific affinity and, hence, exploring the feasibility of using such interactions in clinical diagnosis. In this study, we used the optical waveguide-based particle plasmon resonance biosensor for quantitative measurement of biomolecular interaction kinetics. For the first part, two configurations of biosensing chips were used. Chip1 has a one-dimensional surface grating structure with a period of 833 nm by stamping with UV glue on a glass slide and gold nanoparticles are modified on the opposite side of the glass slide. Chip2 has a grating structure with a period of 833 nm by stamping on a photopolymerizable sol-gel layer which is coated on a glass slide and gold nanoparticles are modified on the sol-gel layer. The planar waveguides for chip1 and chip2 are the glass slide and the photopolymerized sol-gel layer, respectively.
Detection of the optical resonant reflective position from waveguide surface enables high sensitivity label-free biosensing. The light source in this setup was a diode-pumped laser (532nm). The sensor resolution achieved by the gold nanoparticles-modified biosensing chips was 2.8×10-5 RIU for chip1 and 1.1×10-4 RIU for chip2. The detection limit for anti-DNP antibody was determined to be 1.4×10-11 M for chip1 and 5.4×10-10 M for chip2. Unfortunately, even we could observe the signal-time sensorgram, we could not measure the kinetic constants because of the low S/N ratio achieved by these optical setups.
For the second part, a simple and label-free biosensing method has been developed for the determination of anti-ovalbumin antibody (anti-OVA) and anti-Mouse IgG antibody and monitoring their biomolecular interactions by using the fiber-optic particle plasmon resonance (FOPPR) biosensor. The FOPPR sensor is based on gold nanoparticles-modified optical fiber where the gold nanoparticle surface has been modified by a mixed self-assembled monolayer for conjugation of receptor (ovalbumin or mouse IgG) to detect the corresponding analyte (anti-OVA or anti-mouse IgG). During the detection process, an analyte reacts with a receptor immobilized on the optical fiber and their interaction can be monitored in real-time. The detection limits for anti-OVA antibody and anti-mouse IgG were determined to be 2.4×10-9 M and 4.3×10-9 M, respectively. In addition, by assuming a Langmuir type of adsorption isotherm, the quantitative measurement of binding kinetics, including the association and dissociation rate constants, yields a ka of 5.5×103 M-1s-1 and a kd of 3.5×10-4 s-1 for OVA/anti-OVA, and a ka of 1.9×106 M-1s-1 and a kd of 1.7×10-2 s-1 for mouse IgG/anti-mouse IgG. We demonstrate that the FOPPR biosensor can study real-time biomolecular interactions.

總目錄
中文摘要 i
Abstract iii
總目錄 v
圖目錄 ix
表目錄 xiv
第一章 緒論 1
1.1生物分子間交互作用動力學 1
1.2奈米材料 6
1.2.1 何謂奈米材料 6
1.2.2 奈米材料的種類與特性 7
1.2.3 奈米材料的製備方法 8
1.2.4 奈米材料的應用 9
1.2.5 金奈米粒子的簡介 10
1.2.6 粒子電漿共振(Particle Plasmon Resonance,PPR) 11
1.3生物感測器 13
1.3.1 簡介 13
1.3.2 光波導(optical waveguide)的原理與介紹 15
1.3.3 Guided mode resonant phenomenon 17
1.3.4 光纖簡介 19
1.3.5 逐漸消失場理論 20
1.3.6 光纖式粒子電漿共振感測器 21
第二章 平面光波導粒子電漿共振生化感測平台 22
2.1前言 22
2.2儀器設備 24
2.3實驗材料 25
2.4實驗藥品 26
2.4.1 化學藥品 26
2.4.2 生化藥品 27
2.5圓球形金奈米粒子合成 28
2.5.1 金鹽類溶液配製 28
2.5.2 有機相圓球形金奈米粒子合成 28
2.5.3 有機相圓球形金奈米粒子結構鑑定 29
2.6光波導基材前處理 31
2.6.1 玻璃片前處理 31
2.6.2 光聚合溶膠凝膠材料前驅物製備 31
2.7平面光波導的製作 32
2.7.1 奈米粒子–光柵異側型晶片的製備 32
2.7.2 奈米粒子–光柵同側型晶片的製備 34
2.8「平面光波導粒子電漿共振感測器」感測能力測試 35
2.9「平面光波導粒子電漿共振感測器」對生物分子樣品之檢測 39
2.9.1 前言 39
2.9.2 平面光波導層的表面官能化 39
2.9.3 非特異性吸附之探討 41
2.9.4 anti-DNP 標準品的檢測 43
2.9.5 Streptavidin標準品之檢測和MALDI-TOF MS之定性檢測 46
2.10系統背景雜訊比較 48
第三章 光纖式粒子電漿共振生化感測平台 57
3.1前言 57
3.2實驗設備 58
3.3實驗材料 59
3.4實驗藥品 60
3.4.1 化學藥品 60
3.4.2 生化藥品 61
3.5光纖基材前處理 62
3.5.1 光纖的裁切與研磨 62
3.5.2 光纖的清洗 62
3.6光纖感測晶片的製作 63
3.6.1 圓球形金奈米粒子的修飾 63
3.6.2 晶片封裝 63
3.7儀器架構和工作原理 65
3.8不同環境折射率溶液之檢測 66
3.9 anti-ovalbumin antibody之檢測與分子間動力學之研究 68
3.9.1 修飾ovalbumin探針分子於金奈米粒子表面 68
3.9.2 非特異性吸附之探討 70
3.9.3 偵測極限(Limit of Detection) 73
3.9.4 檢測anti-OVA antibody 標準品 75
3.9.5 鍵結常數(binding constant,Kf)的計算 77
3.9.6 結合速率常數(ka)與分解速率常數(kd)的計算 79
3.9.7 再生實驗 87
3.10 anti-mouse IgG antibody標準品檢測與分子間動力學之研究 89
3.10.1 修飾mouse IgG於金奈米粒子表面 89
3.10.2 檢測anti-mouse IgG antibody標準品 91
3.10.3 鍵結常數(binding constant,Kf)的計算 93
3.10.4 結合速率常數(ka)與分解速率常數(kd)的計算 94
3.10.5 再生實驗 98
第四章 結論 100
第五章 參考文獻 102



圖目錄
圖1-1 抗原–抗體鍵結示意圖[4] 2
圖1-2(a)SPR系統訊號圖(b)結合動力學數據處理[1] 3
圖1-3(a)QCM系統的濃度對鍵結量關係圖(b)結合動力學數據處理[2] 4
圖1-4各種不同免疫檢測方式(a)競爭法;(b)直接分析法;(c)三明治法[5] 5
圖1-5奈米級單位尺度示意圖[6] 6
圖1-6粒子電漿共振現象[18] 11
圖1-7金奈米粒子的外觀和TEM圖以及吸收光譜圖[18] 12
圖1-8生物感測器架構圖[22] 14
圖1-9 (a)血糖儀[23];(b)驗孕棒的外觀 14
圖1-10光子晶體生物感測器架構圖[26] 17
圖1-11光子晶體感測晶片檢測示意圖[26] 18
圖1-12光纖剖面圖 19
圖1-13光在不同介質層中的折射現象圖 20
圖1-14漸逝波示意圖 20
圖1-15光纖感測區之檢測原理 21
圖2-1光波導粒子電漿共振感測器架構圖 23
圖2-2金奈米粒子溶液的吸收光譜圖 29
圖2-3金奈米粒子的(a)TEM圖和(b)粒徑分析 30
圖2-4(a)玻璃片上金奈米粒子的SEM 圖(b)粒徑分析 33
圖2-5玻璃片上壓印光柵的SEM圖 33
圖2-6奈米粒子–光柵異側型晶片對不同折射率溶液之訊號圖 37
圖2-7感測器對不同折射率感測之檢量線 37
圖2-8 (a)DNP分子的修飾流程圖; (b)Biotin分子的修飾流程圖 40
圖2-9非特異性吸附實驗檢測結果 42
圖2-10 anti-DNP即時偵測訊號圖 43
圖2-11 chip1對anti-DNP標準品的檢測結果 45
圖2-12 Streptavidin標準品的即時偵測圖 47
圖2-13 MALDI-TOF MS檢測圖譜 47
圖2-14(a)LED的光強度訊號圖;(b)綠光雷射光源的光強度訊號圖 49
圖2-15(a)調頻LED的光強度-時間訊號圖;(b)調頻綠光雷射的光強度-時間訊號圖 51
圖2-16(a)雷射光源對PSD之訊號圖(b)殘差分析圖 53
圖2-17(a)光纖感測系統的即時訊號圖;(b)殘差分析圖 54
圖2-18(a)平面光波導系統的即時訊號圖;(b)殘差分析圖 55
圖3-1光纖感測晶片封裝圖 64
圖3-2光纖式粒子電漿共振感測器架構圖[29] 65
圖3-3不同環境折射率溶液即時偵測圖 67
圖3-4感測不同環境折射率溶液之檢量線 67
圖3-5 Ovalbumin修飾流程圖 69
圖3-6利用Insulin進行非特異性吸附實驗之訊號圖 72
圖3-7利用BSA進行非特異性吸附實驗之訊號圖 72
圖3-8 訊號與濃度關係圖 73
圖3-9檢測anti-OVA之即時偵測訊號圖 76
圖3-10 anti-OVA antibody標準品之檢量線 76
圖3-11 OVA/anti-OVA 鍵結常數之數據處理 78
圖3-12 槽道中反應之濃度變化示意圖和訊號變化示意圖 83
圖3-13殘差分析結果(a)合適的訊號區間(b)不合適的訊號區間 83
圖3-14 兩個不同濃度的anti-OVA antibody即時偵測圖 84
圖3-15計算動力學常數之訊號處理圖(a)第一段訊號處理和殘差分析結果(右);(b)第二段訊號處理和殘差分析結果(右) 85
圖3-16 anti-OVA的鍵結與再生實驗之即時偵測訊號圖 87
圖3-17再生反應下計算分解速率常數的訊號處理圖 88
圖3-18 mouse IgG探針分子修飾流程圖 90
圖3-19 anti-mouse IgG標準品檢測之即時偵測訊號圖 92
圖3-20 anti-mouse IgG標準品之檢量線 92
圖3-21 mouse IgG/anti-mouse IgG 鍵結常數之數據處理 93
圖3-22兩個不同濃度的anti-mouse IgG之即時偵測訊號圖 94
圖3-23計算動力學常數之訊號處理圖(a)第一段訊號處理和殘差分析結果(右);(b)第二段訊號處理和殘差分析結果(右) 95
圖3-24 anti-mouse IgG的鍵結與再生實驗之即時偵測訊號圖 98
圖3-25再生反應下計算分解速率常數的訊號處理圖 99


表目錄
表2-1不同種類平面光波導晶片對環境折射率變化之感測解析度比較 38
表2-2 配製不同濃度的anti-HSA與anti-DNP之濃度區間 42
表2-3 兩種平面光波導晶片對anti-DNP標準品檢測結果比較 45
表3-1 固定化之OVA分子對anti-OVA的結合反應動力學常數 86
表3-2 固定化之mouse IgG分子對anti-mouse IgG的結合反應動力學常數 97
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