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研究生:林承鴻
研究生(外文):Lin, Cheng-hung
論文名稱:藉由定點突變建構細胞色素P450 BM3以從事丁烷之位置與立體選擇性之催化反應
論文名稱(外文):The Study of Regio- and Stereo-selective Hydroxylation of Butane via Cytochrome P450 BM3 Variants
指導教授:俞聖法魏國佐
指導教授(外文):Yu, Steve Sheng-FaWei, Guor-Tzo
口試委員:俞聖法魏國佐王少君
口試委員(外文):Yu, Steve Sheng-FaWei, Guor-TzoWang, Shau-Chun
口試日期:2011/07/14
學位類別:碩士
校院名稱:國立中正大學
系所名稱:化學暨生物化學研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2011
畢業學年度:99
語文別:中文
論文頁數:140
中文關鍵詞:定點突變細胞色素位置與立體選擇性酵素催化
外文關鍵詞:variantsmutationRegio- and Stereo-selectivecatalysisCytochrome P450 BM3
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來自Bacillus megaterium 的細胞色素 P450 BM3 對其天然受質脂肪酸具有高度的專一性。此細胞色素使用大氣中的氧氣當做氧化劑。
我們成功的從大腸桿菌中表現P450 BM3 並且藉由層析管柱純化具有His-tag 的重組蛋白。本研究將利用定點突變(site mutation) P450 BM3 序列以PCR 複製載體或序列直接嵌入載體的方法,在不改變P450 reductase 序列的況下,探討三組定點突變。
第一組(Ala328Phe)簡稱(F328)和第二組(Ala328Phe, Leu188Pro)簡稱(F328+P188)和第三組(Ala328Phe, Leu188Pro, Ala74Glu)簡稱(F328+ P188+E74)對具有光學活性的丁烷進行催化影響之觀察。這個突變過後的蛋白質內依然含鐵,丁烷並不會被原生型的P450 BM3 所氧化,但是這些P450 BM3突變序列可以將具有光學活性的丁烷和正丁烷氧化成具有光學活性的2-丁醇。
利用三組突變序列之植株與正丁烷進行細菌反應,經活性測試後,最佳的突變序列為(F328+P188+E74),藉由突變方式,得到預期氧化短碳鏈的烷類化合物的酵素。並且利用產物分佈情況,可推得平衡常數和動力學同位素效應,由結果推測當受質進入活性中心口袋時,會利用最適合的鍵結方式,進行立體或位置性之催化,造成不同的產物。

Cytochrome P450 BM3 from Bacillus megaterium display a rather excellent substrate specificity. This enzyme can only hydroxylate fatty acid by using atmospheric dioxygen as an oxidant. We successfully expressed and purified the recombinant His-tagged protein (P450 BM3) from E. coli. by a simple metal-affinity chromatography. Employing site-directed mutagenesis studies, we obtained the three strains to study their butane activation chemistry without any alternation of P450 reductase.
The three mutants are cytochrome P-450 BM3 Ala328Phe denoted as “F328”, P-450 BM3 Ala328Phe and Leu188Pro that is denoted as “F328+P188”, and cytochrome P-450 BM3 Ala328Phe,Leu188Pro,Ala74Glu that is denoted as “F328+P188+E74”. These three strains exhibiting iron heme could carry out n-butane activation to 2-butanol in catalytic manner. Interestingly, n-butane can not be oxidized by the wild-type enzyme.
The turnover activity data indicates that the best mutant for butane activation is F328+P188+E74. Using chiral di-deuteriated n-butanes as its subtrates, to analyze the distribution of products by GC and GC-MS, we can derive the equilibrium constants for secondary C-HR versus C-HS pointing to the iron heme center and the H/D kinetic isotope effects on the high valent iron oxo species (compound I) in P450 enzyme across the C-H bond.
The outcomes on the hydroxylation mediated by cytochrome P450 BM3 variants presented as fully retention of configuration as well as the H/D kinetics isotope effects in the range of 3.45.5 suggest the reaction proceeds in concerted insertion manner. Evidently, when the small alkanes enter the pocket of enzymatic reactive center, there are significant weak interactions including van der Waals interaction or London Dispersive force to tune the products hydroxylation with high regio-selectivity and stereo-selectivity.

摘要 I
Abstract II
致謝 IV
目錄 VIII
圖目錄 XIV
表目錄 XVII
化合物目錄 XVIII
第一章 緒論 1
1.1 酵素於有機合成應用實例簡介 3
1.1.1 具有還原反應功能酵素 3
1.1.2 具有氧化反應功能酵素 3
1.2 巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium) 5
1.3 Cytochrome P450的分類 6
1.4 Cytochrome P450 BM3 8
1.5 P450 BM3的催化機制 9
1.6 單加氧酶的羥基化反應之反應機構 10
1.6.1 自由基型機構(Radical mechanism) 10
1.6.2 直接型機構(Concerted mechanism) 12
1.6.3 離子型機構(Cation based mechanism) 12
1.7 同位素動力學效應理論(Kinetic isotope effect) 14
1.7.1 動力學同位素的起源 [37] 15
1.7.2 一級動力學同位素效應 17
1.7.3 二級動力學同位素效應 [37] 17
1.7.4 其他動力學同位素效應 20
1.8 兩種複雜的情況在動力學同位素效應 20
1.8.1 複雜動力學 (Kinetic Complexity) [26] 20
1.8.2 量子穿隧效應(Quantum Tunneling effect) 21
1.9 研究目的 22
第二章 實驗步驟與方法 24
2.1 藥品試劑 24
2.2 儀器設備 26
2.3 實驗流程 29
2.4 建立pET21_BM-3的表現載體 30
2.5 定點突變 (Site-Directed Mutagenesis) (三組序列 ) 33
2.5.1 利用套件 (Kit)進行定點突變實驗步驟 34
2.5.2 突變所需的Primer 37
2.6 聚合酶連鎖反應PCR原理 39
2.6.1 聚合酶連鎖反應(PCR)流程圖 41
2.7 設計酵素的方法 42
2.7.1 理想化設計 (Rational Design) 42
2.7.2 導引式演化 (Directed Evolution) 43
2.7.3 結合理想化設計與導引式演化 43
2.8 有機合成步驟 45
2.8.1 合成(2S,3S)-2,3-Butandiol Di-p-tosylate 45
2.8.2 合成(2R,3R)-2,3-Butandiol Di-p-tosylate 46
2.8.3 合成(2R*,3S*)-2,3-Butandiol Di-p-tosylate 47
2.8.4 合成(2R,3R)-[2-2H1, 3-2H1]butane 48
2.8.5 合成(2S,3S)-[2-2H1, 3-2H1]butane 49
2.8.6 合成(2R*,3S*)-[2-2H1, 3-2H1]butane 50
2.9 細菌培養 51
2.10 測試活性方法 52
2.11 利用兩株突變序列進行細菌培養和活性測試 53
2.12 利用三株序列進行細菌培養和活性測試 53
2.13 結合理想化設計與導引式演化方法進行突變 55
2.14 P450 BM3細菌與丁烷產生活性的結果 58
2.14.1 n-butane和細菌(P188)羥化反應 58
2.15 P450 BM3細菌(P188)與含氘丁烷產生活性的結果 59
2.15.1 (2R,3R)-butane和細菌(P188)羥化反應 59
2.15.2 (2S,3S)-butane和細菌(P188)羥化反應 60
2.15.3 (2R*,3S*)-butane和細菌(P188)羥化反應 61
2.16 衍生化細菌(P188)產物(具有光學活性的含氘二丁醇) 62
2.16.1 衍生化的目的與功用 63
第三章 結果與討論 64
3.1 衍生化細菌(P188)活化產物 64
3.1.1 衍生化n-butane細菌(P188)羥化反應 64
3.1.2 衍生化(2R,3R)- butane之細菌(P188)羥化反應 65
3.1.3 衍生化(2S,3S)- butane之細菌(P188)羥化反應 66
3.1.4 衍生化(2R*,3S*)-butane之細菌(P188)羥化反應 67
3.2 細菌(P188)反應後衍生化的數據分析 68
3.2.1 衍生化n-butane之細菌(P188)羥化反應 69
3.2.2 衍生化(2R,3R)- butane之細菌(P188)羥化反應 70
3.2.3 衍生化(2S,3S)-butane之細菌(P188)羥化反應 71
3.2.4 衍生化(2R*,3S*)-butane之細菌(P188)羥化反應 72
3.3 數據分析 73
3.3.1 動力學常數數據 73
3.4 動力學常數數據 75
3.4.1 受質與細菌反應(P188)之動力學常數數據 75
3.5 細菌(E74)反應後衍生化的數據分析 76
3.6 細菌(E74)反應後衍生化的數據分析 77
3.6.1 受質與細菌反應(E74)之動力學常數數據 78
3.7 電腦模擬圖 79
3.8 利用結晶解出結構 80
3.9 3mt v.s. F-octane 結構圖 82
3.9.1 C3-activation 82
3.9.2 C2-activation 83
3.10 F328 P188 v.s. (S,S)-butane電腦模擬圖-HR 84
3.11 F328 P188 v.s. (S,S)-butane電腦模擬圖-DS 85
3.12 推測反應方式 87
3.12.1 P450 BM3與n-butane進行反應 87
3.12.2 P450 BM3與(R,R)-butane進行反應 88
3.12.3 P450 BM3與(S,S)-butane進行反應 89
3.12.4 P450 BM3與meso-butane進行反應 90
第四章 結論 91
參考文獻 92
附錄 96
I. 簡稱與產物對照表 96
II. 合成產物之核磁共振光譜圖數據 98
III. 氣相層析質譜圖(GC-MS) 99
IV. 核磁共振光譜圖(NMR) 116

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