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研究生:黃于真
研究生(外文):Huang,YuJane
論文名稱:結合光纖定域化電漿共振(FO-PPR)與液相層析質譜儀開發免標定線上偵測技術
論文名稱(外文):Online analysis using label-free optical fiber particle plasmon resonance (FO-PPR) biosensor to couple with liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS)
指導教授:王少君
口試委員:周禮君陳政男
口試日期:2011-07-12
學位類別:博士
校院名稱:國立中正大學
系所名稱:化學暨生物化學研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2011
畢業學年度:99
語文別:中文
論文頁數:95
中文關鍵詞:光纖式奈米生物感測器液相層析電噴灑質譜儀
外文關鍵詞:LCESIMSPPRbiosensor
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相較傳統的感測技術,例如螢光或是放射性分析檢測法,免標定生物感測技術具有快速簡易、可即時偵測且降低標定物破壞鍵結交互作用的風險,對於生物動力學、親和力及濃度鑑定而言為一個極佳的分析工具。我們所開發的免標定生物感測器主要是利用貴金屬定域化表面電漿共振(PPR)的特性來製作光學感測的微流體晶片,對生物分子間交互作用作偵測。PPR 波帶的吸收度及波帶位置對於金屬奈米粒子所處的外在環境折射率有高度相關性。此PPR 特性的晶片,具有免標定(label-free)、即時偵測和只須少量的樣本的優點。結合光纖之多次全反射的傳導原理,偵測靈敏度可大幅提昇。在此研究中我們移除塗覆層的光纖表面組裝金圓球奈米粒子,活化後修飾生物素(biotin),藉由抗原-抗體間的專一特性,偵測卵白素(streptavidin),偵測極限可達10-8M。接著將線上偵測晶片以高溫DI水沖洗,破壞streptavidin/ biotin之間鍵結,以脫附光纖上的streptavidin,結合C4液相層析(LC)分析管柱濃縮並去雜質,最後用電噴灑質譜儀(ESI-MS)確認。
成功整合FO-PPR與LC-ESI-MS連結的工作介面後,我們以另一套系統OVA/anti-OVA測試;在光纖式奈米生物感測器上修飾了OVA探針分子,注入偵測物使anti-OVA被鍵結住,接著用glycine buffer脫附OVA/anti-OVA之間鍵結,脫附後蛋白質樣品導入質譜儀鑑定,
II
並驗證了適當的回收率與再現性,以此確認我們開發的方法是可行的。
關鍵字:光纖式奈米生物感測器、粒子電漿共振、液相層析電噴灑質譜儀、anti-OVA、蛋白質。
Unlike conventional immuno-biosensing technologies using fluorescence or radioactive detections which require chemical derivatives to tag detection markers, label-free detection using particle plasmon resonance, also known as localized surface plasmon resonance, on noble metal nano-particles is a simpler and less time-consuming method with less risk to alter the bind- ing conjugation of immunoassays. Particle plasmon resonance (PPR) is therefore a suitable label-free optical detection
method to develop microfluidic immuno-biosensor when least amount of sample consumption is preferable. In this thesis, antigen functionalized gold nano-particles are coated on the cladding layer of a stripped optical fiber segment sealed in microchannel. Intensity attenuation of propagating light through
the fiber is sensitive to the docking events with the molecular probes immobilized on the nano-particles. The relation of intensity attenuation versus target molecule concentration can be used to determine target molecules such as antibodies. Having been docked with biotion coated nano-particles on the claddingIVfiber segment in microchannel, strepavidin proteins are desorbed using hot waters to flush out off the microchannel to detect with liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for secondary confirmation. Similarly, anti-ovalbumin antibody docked on the immobilized ovalbumin on the nanoparticles is washed with glycine buffer to desorb and to confirm with LC-MS.Suitable recovery eith adequate reproducibility has been found to proce the feasibility of this iustrumentation system.
Keywords: gold nanoparticle、biosensor、PPR、LC-ESI-MS。
摘要............................................................................................. I
總目錄........................................................................................II
表目錄.................................................................................... VII
圖目錄................................................................................... VIII
1-0 研究動機 .............................................................................. 1
1-1 圓球形金奈米粒子(gold nanoparticles) ................. 3
1-1-1 PPR ( Particle Plasmon Resonance)現象 .............. 3
1-2 光纖............................................................................ 5
1-2-1 光纖的簡介 ....................................................................... 5
1-2-2 內全反射現象(Internal Total Reflection) ................... 6
1-2-3 逐漸消失場 ....................................................................... 8
1-2-4 光纖式奈米生物感測器 ................................................. 10
1-3 自我組裝單層(Self-Assembled Monolayer, SAMs) 12
1-4 液相層析質譜儀簡介 ............................................. 14
1-4-1 噴灑法原理介紹 ..................................................... 14
1-4-2 四極柱偵測器原理介紹 ................................................. 16
第二章 研究方法 ................................................................. 18
VI
2-1藥品與儀器 ......................................................................... 18
2-1-1 藥品 ................................................................................. 18
2-1-2 儀器設備 ......................................................................... 19
2-2 光纖式奈米生物感測器光學實驗 .................................... 20
2-2-1 圓球型金奈米粒子的製備 ............................................. 20
2-2-2 金奈米粒子於光纖表面進行固定化 ............................ 21
2-2-3 微流體系統 ..................................................................... 22
2-2-4 光纖式表面電漿共振感測系統..................................... 22
2-2-5 粒子電漿共振感測器的靈敏度..................................... 23
2-2-6 修飾streptavidin探針混合自我組裝單層(mixed SAMs) 24
2-2-7 修飾anti-OVA探針混合自我組裝單層 ...................... 25
2-2-8 修飾 interleukin-1β(IL-1β)探針混合自我組裝單層 .... 25
2-3 建立LC-ESI/MS檢測方法與層析條件 .......................... 26
2-3-1 移動相溶液配置 ............................................................. 27
2-3-2 層析條件 ......................................................................... 27
2-4 微流體晶片與質譜儀介面連結線上即時偵測 ................ 28
第三章 實驗結果與討論 ..................................................... 30
A.Biotin/streptavidin .................................................................. 30
VII
3-1光纖式奈米生物感測器光學實驗 ..................................... 30
3-2 建立LC-ESI/MS檢測streptavidin方法與層析條件 ..... 32
3-2-1 電噴灑質譜儀偵測streptavidin標準品 ..................... 32
3-2-2 比較不同移動相對分析物影響..................................... 35
3-2-3 選擇monomer或tetramer ............................................. 36
3-2-4 結合高效率液相層析儀的層析條件並鍵利檢量線 .... 42
3-3 介面未連結前脫附方法確立 ............................................ 46
3-4 微流體晶片與質譜儀介面連結線上即時偵測 ................ 50
B. OVA/anti-OVA ....................................................................... 57
3-5 OVA/anti-OVA的光纖式奈米生物感測器光學實驗 ...... 58
3-6 建立LC-ESI/MS檢測anti-OVA的方法與層析條件 .... 60
表3-3 梯度流析時間與移動相比例改變。 ........................... 67
3-7 介面未連結前脫附方法確立 ............................................ 70
3-8 微流體晶片與質譜儀介面連結線上即時偵測 ................ 72
C.Anti-IL1β/Interleukin 1 beta................................................... 75
3-9 Anti-IL1β/Interleukin 1 beta光學訊號 .............................. 75
3-10 建立LC-ESI/MS檢測IL1β抗原的的方法.................. 77
第四章 結論 .............................................................................. 78
第五章 參考文獻 ..................................................................... 79
VIII
表目錄
表3-1 鎖定三荷質比注入不同濃度的streptavidin作偵測,可得不同訊號強度。 ................................................................... 38
表3-2 在tetramer模式下鎖定三荷質比注入不同濃度的streptavidin作偵測,可得不同訊號強度,積分成面積作比較。 41
表3-3 梯度流析時間與移動相比例改變。 ........................... 67
IX
圖目錄
圖1-1 金屬奈米球表面的字由電子受到外加磁場作用產生偶極震盪。 .................................................................................. 4
圖1-2 光纖結構示意圖。 ......................................................... 6
圖 1-3 光的反射與折射。 ........................................................ 7
圖1-4 以粒子說解釋光全反射時的滲透現象(Goss-Haenchen) ...................................................................................................... 9
圖1-5 以電磁波解釋光全反射時的滲透現象(Goss-Haenchen) ...................................................................................................... 9
圖1- 6 光束在光纖中進行全反射。 ........................................ 9
圖1-7 逐漸消失場螢光感測器示意圖。 ............................... 11
圖1-8 光纖上修飾探針分子,可偵測分析物。 ................... 11
圖1-9 理想自我組裝單層(Self-Assembled Monolayers)示意圖。 ........................................................................................ 13
圖1-10 光纖上金奈米粒子的修飾過程。 ............................. 13
圖1-11 電噴灑游離法。 ......................................................... 15
圖1-12 四極柱質量分析器示意圖。 ..................................... 17
圖2-1 光纖式表面電漿共振感測系統之實驗架構。 ........... 23
X
圖2-2 將微流體晶片置於開發中的工作介面,以連結LC-ESI -MS。 ......................................................................................... 29
圖3-1-1光纖式奈米生物感測器偵測streptavidin光學實驗訊號變化圖。 ................................................................................ 31
圖3-2-1 Streptavidin標準品的全質譜訊號圖。 .................... 33
圖3-2-2 計算streptavidin分子量。 ....................................... 34
圖 3-2-3 Streptavidin的全質譜訊號圖,上圖為醋酸銨水溶液作為水相移動相,下圖以醋酸水溶液作水相移動相。 ....... 36
圖 3-2-4 鎖定不同荷質比的訊號面積圖。 .......................... 38
圖 3-2-5 Streptavidin標準品在tetramer偵測模式的全質譜圖。 .................................................................................................... 40
圖3-2-6 在tetramer模式下偵測streptavidin的訊號面積圖。 .................................................................................................... 40
圖3-2-7 分析物經過C4分析管柱進入質譜儀。 .................. 43
圖3-2-8 (A)為標準品streptavidin層析圖,訊號出現時間約為1.7分鐘;(B)為streptavidin質譜圖。 ................................... 44
圖3-2-8 標準品streptavidin的檢量線。 ............................... 45
XI
圖3-3-1 (A)層析圖中確實無streptavidin訊號,(B)經過層析後streptavidin訊號出現在1.8 min處,(C)確認脫附後streptavidin完全被沖提出來無殘留。 ................................ 47
圖3-3-2 被熱水破壞後的biotin失去活性故無法檢測出溶液中含有streptavidin。 ......................................................... 49
圖3-4-1 感測晶片自工作介面連接上LC-ESI-MS進行分析。 51
圖3-4-2 連接了C4 trap column和analytical column卻無法得到具濃縮效果的最佳圖譜。 ................................................... 51
圖3-4-3以100μl loop取代5公分的trap column。 ............. 52
圖3-4-3 上圖是streptavidin自原型機晶片沖洗下來的經過100μl loop進入C4 分析管柱,層析圖譜訊號分裂;下圖為streptavidin標準品溶以同樣條件偵測,確實是分岔圖譜。 .................................................................................................... 53
圖3-4-5 將連接介面上100μl的位置改為20μl loop。 ........ 55
圖3-4-6對照組streptavidin標準品層析訊號。 ................... 56
圖3-4-7 streptavidin標準品對照組全質譜訊號圖,質量分析為55,028 Da。 .......................................................................... 56
XII
圖3-4-8 脫附下來的streptavidin20μl經過LC/ESI/MS的層析圖。 ............................................................................................ 57
圖3-5-1 OVA/anti-OVA鍵結後用glycine buffer脫附的及時光度訊號圖。 ............................................................................ 59
圖 3-6-1 Anti-OVA標準品的全質譜訊號。 ......................... 62
圖 3-6-2-A 等位沖堤50/50在2.77min處出現訊號。 ........ 63
圖 3-6-2-B 等位沖堤70/30在1.37min處出現anti-OVA訊號。 .................................................................................................... 63
圖 3-6-2-C 等位沖堤80/20在1.43與3.05min處出現anti-OVA訊號。 ...................................................................... 64
圖3-6-3-a 全質譜圖中不含anti-OVA訊號。 ...................... 64
圖3-6-3-b 以70/30等位沖堤後在1.37 min處出現anti-OVA訊號。 ........................................................................................ 65
圖3-6-3-c以70/30等位沖堤後在1.45與3.06min處各出現anti- OVA的質譜訊號。 ......................................................... 66
圖 3-6-4 anti-OVA梯度流析在有機相比例高時析出。 ...... 68
圖3-6-5(A) anti-OVA標準品經過分析管柱滯留後訊號出現在14.7min處; (B)為全質譜訊號圖。 ................................. 69
XIII
圖3-6-6 導入不同濃度之anti-OVA,依其訊號強度製做成檢量線。 ........................................................................................ 70
圖3-7-1 溶劑與anti-OVA層析訊號圖。 ............................. 71
圖3-7-2 溶劑訊號的全質譜圖。 ............................................ 71
圖3-7-3 層析後anti-OVA全質譜圖。 ................................. 72
圖3-8-1微流體晶片與質譜儀介面連結線上即時偵測脫附後的anti-OVA。 ........................................................................... 74
圖3-8-2 16分鐘處訊號的全質譜圖。 ................................... 74
圖3-9-1 光纖感測晶片偵測IL1β抗原訊號變化。 ............ 76
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