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研究生:王萬鈺
研究生(外文):Wan-Yu Wang
論文名稱:鏈黴菌的端粒連結蛋白與末端蛋白的純化與交互作用
論文名稱(外文):Purification and demonstration of the interaction between TapC and TpgC of Streptomyces.
指導教授:楊千金
指導教授(外文):Chien-Chin Yang
學位類別:碩士
校院名稱:中原大學
系所名稱:化學研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2011
畢業學年度:99
語文別:中文
論文頁數:80
中文關鍵詞:鏈黴菌端粒連結蛋白末端蛋白
外文關鍵詞:Streptomycesterminal proteintelomere associate protein
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摘 要
端粒連結蛋白 (Tap) 與末端蛋白 (Tpg) 在維持鏈黴菌線形染色體或質體中扮演必要的角色,鏈黴菌線形染色體的複製是由中心的複製起點以一般複製方式向兩側進行,當複製進行到末端的時後會在3』端留下缺口,此時需要其他的複製機制去補齊。2003年Bao 和 Cohen利用酵母菌雙雜交法與免疫沉澱法證明鏈黴菌的端粒連結蛋白與末端蛋白具有交互作用,此外他們還用足跡實驗發現端粒連結蛋白會與末端第二、三迴文區結合。由此推論末端的補齊至少需要端粒連結蛋白與末端第二、三迴文區結合並且把末端蛋白帶到末端作為引子進行DNA合成。
本論文分成四部分,第一部分是質體構築,把端粒連結蛋白與末端蛋白的基因分別剪接到蛋白質表現質體pet15,讓表現的蛋白質在N端接上(His)6標識。另外,構築末端蛋白的基因在蛋白質表現質體prsetA,此方式為得不含(His)6標識的末端蛋白。第二部分為蛋白質表現及純化,首先尋找表現條件,例如:培養的溫度、IPTG的濃度和轉速,以求得最佳條件得到可溶性蛋白。再利用鎳金屬親和性層析管柱純化接有(His)6標識的端粒連結蛋白與末端蛋白。第三部分活性測試,我們把純化出來的端粒連結蛋白與末端蛋白進行單股末端序列補齊的實驗,結果顯示端粒連結蛋白不僅讓末端蛋白接上第一個核苷酸,還能延伸數個核苷酸。為排除大腸菌去氧核醣核酸聚合酶(DNA polymerase I)的汙染,我們藉由增加沖洗管柱的緩衝溶液體積或改變緩衝溶液中咪唑(imidazole)和氯化鈉的濃度進行純化。第四部分交互作用,我們利用鎳金屬離子親和性層析管柱的方式,把具有(His)6標識的端粒連結蛋白先固定在樹脂上,再用來純化不含(His)6標識的末端蛋白。結果顯示在0.1M氯化鈉緩衝溶液的條件下,端粒連結蛋白與末端蛋白有交互作用,在0.5M 氯化鈉緩衝溶液的條件下沒有交互作用。

Abstract
Telomere associate protein (Tap) and terminal protein (Tpg) of Streptomyces are important for maintaining linear chromosomes of Streptomyces. The replication of linear chromosomes of Streptomyces proceeds from central origin of replication to both sides. The replications proceeding to the ends are not completed. It will leave a gap at 3』 end which needs a different machinery to patch. In 2003, Bao and Cohen reported the interactions between Tap and Tpg of Streptomyces lividans by using yeast two-hybrid assay and immunoprecipitation experiments. Besides, they used footprinting analysis to discover that TapC binds DNA end at palindrome II and III. It suggested that the end-patch at least needs TapC binding the II and III palindrome sequence and recruiting TpgC to synthesize DNA.
My research includes four parts. First, cloning plasmids. We cloned the Tap gene and the Tpg gene into expression protein vector, pet15, to tag (His)6 to the N-terminal of the expressed proteins. To get wild-type terminal proteins, the gene was engineered into prsetA instead. Second, expressing and purifying proteins. We first searched the best conditions, for example: culturing temperatures, concentrations of IPTG and rotation rate to get suitable amounts of soluble form of proteins, and then purified the (His)6-TapC and (His)6-TpgC by means of immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). Third, examining the activity of proteins. The results indicated that TapC and TpgC not only tagged the first nucleotide to TP but also extended several nucleotides away. To exclude the possibility of contamination of E.coli DNA polymerase I, the sample was washed more thoroughly at the washing step by increasing the volume of washing buffer and the concentration of imidazole and sodium chloride. Fourth, interaction of TpgC and TapC. (His)6-TapC was first bound on resins and then used to purify the TpgC. The results indicated that the interactions happened in 0.1 M NaCl, but not 0.5 M NaCl.

目錄
摘要 I
Abstract II
目錄 III
圖目錄 V
表目錄 VII
第一章、緒論
一、鏈黴菌的簡介 1
二、鏈黴菌的染色體與質體 1
三、鏈黴菌線形染色體的複製 2
四、論文研究的內容 4
第二章、材料與方法
一、儀器部分 9
二、藥品部分 10
三、菌種與質體 11
四、本論文所用的引子(primer) 12
五、實驗方法 13
六、藥品與試劑的製備 21
七、實驗流程 23
第三章、結果
一、質體的構築 31
二、蛋白質的表現與純化 34
(一)、可溶性蛋白的最佳表現條件 34
(二)、蛋白質純化 40
三、鏈黴菌的末端單股序列補齊 47
四、端粒連結蛋白與末端蛋白的交互作用 49
第四章、討論 53
參考文獻 58
附錄 61


圖目錄
圖1-1、鏈黴菌的線形染色體與線形質體 5
圖1-2、端粒連結蛋白(TapC)同原體的胺基酸序列比對 8
圖2-1、轉漬的堆疊 20
圖2-2、尋找蛋白質表現菌株的流程圖 24
圖2-3、尋找表現可溶性蛋白的流程圖 24
圖2-4、端粒連結蛋白( TapC )與末端蛋白( TpgC )交互作用的流程圖 29
圖3-1-1、質體tpgC-pet15的構築流程 32
圖3-1-2、質體tpgC-his-prsetA的構築流程 33
圖3-2-1、用1.0 mM IPTG表現(His)6-TpgC,在37℃,誘導3小時的結果 35
圖3-2-2、用不同IPTG的濃度下表現(His)6-TpgC,在28 ℃,誘導3小時的結果 35
圖3-2-3、用0.5 mM IPTG表現TpgC-(His)6,在28 ℃,誘導3小時的結果 36
圖3-2-4、表現不含(His)6標識的TpgC 36
圖3-2-5、(His)6-TapC的蛋白質表現 38
圖3-2-6、(His)6-TapC的蛋白質表現 38
圖3-2-7、(His)6-SCO1738的蛋白質表現 39
圖3-2-8、用不同濃度的IPTG表現(His)6-SCO1738,在28 ℃、誘導3小時的結果 39
圖3-2-9、TpgC-(His)6與(His)6-TpgC的純化 40
圖3-2-10、使用五種條件進行(His)6-TapC的純化 43
圖3-2-11、(His)6-TapC的純度檢測 45
圖3-2-12、(His)6-SCO1738的純化與透析 46
圖3-3-1、鏈黴菌染色體的末端單股序列補齊 48
圖3-4-1、在0.1 M NaCl的條件下進行TapC與TpgC的交互作用 51
圖3-4-2、在0.5 M NaCl的條件下進行TapC與TpgC的交互作用 52
圖3-5-1、質體tpgC-T114H-pet15的構築流程 62
圖3-5-2、不同IPTG的濃度下表現TpgC-A40P,在28 ℃,誘導3小時的結果 65
圖3-5-3、TpgC-(His)6、TpgC-A42D、TpgC-V47T、TpgC-V52D、TpgC-R54P與TpgC-Y55F的蛋白質表現,在28 ℃,以0.5 mM IPTG誘導3小時的結果 65
圖3-5-4、以不同IPTG的濃度表現TpgC-A42D、TpgC-V52D與TpgC-R54P,在28 ℃,誘導3小時的結果 66
圖3-5-5、在20℃,以0.1 mM IPTG表現TpgC-A42D和TpgC-R54P,以0.5 mM IPTG表現TpgC-V47T的結果。 66
圖3-5-6、以不同濃度的IPTG表現TpgC-V52D,在20 ℃,誘導3小時的結果 67
圖3-5-7、表現TpgC-V52D,在20 ℃,以0.1 mM IPTG做不同時間誘導的結果 67
圖3-5-8、以不同濃度的IPTG表現TpgC-T108A、TpgC-T114C與TpgC-T114H,在28 ℃,誘導3小時的結果 68
圖3-5-9、表現不含(His)6標識的TpgC-A40P、TpgC-A42D、TpgC-V52D、TpgC-R54P與TpgC-Y55F,在28 ℃,以0.5 mM誘導3小時的結果 68
圖3-5-10、TpgC-A40P、TpgC-T108A、TpgC-T114C與TpgC-T114H的純化 70


表目錄
表一、菌種目錄 11
表二、質體目錄 11
表三、超音波震盪條件 17
表四、鎳金屬親和性層析管柱的buffer條件 18
表五、西方轉漬法的材料 19
表六、抗生素的配方 21
表七、SDS-PAGE的配方 21
表八、Coomassie blue染劑的配方 21
表九、2X與4X SDS gel loading dye的配方 22
表十、TpgC與TapC的純化以及TapC與TpgC交互作用所用的buffer成分 22
表十一、用鎳金屬親和性管柱層析法純化TpgC-(His)6和(His)6-TpgC的條件 25
表十二、用鎳金屬親和性管柱層析法純化(His)6-TapC的條件 26
表十三、用鎳金屬親和性管柱層析法在變性的條件下純化(His)6-SCO1738的條件 27
表十四、SCO1738的透析條件 27
表十五、單股末端補齊的條件 28
表十六、端粒連結蛋白( TapC )與末端蛋白( TpgC )交互作用的條件 30
表十七、(His)6-TapC的蛋白質總量測定 45

參考文獻
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