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研究生:翁建軒
論文名稱:痘病毒膜蛋白A17與A27形成複合體─兩階段作用模式
論文名稱(外文):Vaccinia viral membrane protein A17 binds to A27 forming a protein complex─A two-step binding mode
指導教授:陳文龍陳文龍引用關係
指導教授(外文):Wenlung Chen
學位類別:碩士
校院名稱:國立嘉義大學
系所名稱:應用化學系研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2011
畢業學年度:99
語文別:中文
中文關鍵詞:痘病毒
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痘病毒為雙股DNA病毒(195 kb),可轉譯病毒本身所需約200種蛋白質。當痘病毒感染宿主細胞時,需要封套蛋白質與宿主細胞膜上的葡萄糖胺聚醣 ( glycosaminglycans, GAGs ) 有專一性辨識機制,例如A27和H3可與硫酸乙醯肝素 ( heparan sulfate, HS ) 相互作用, D8與硫酸軟骨素 ( chondroitin sulfate ) 相互作用。然而A27本身並非膜蛋白質,藉由與A17膜蛋白質相互作用可固定於封套。此研究主要目的是找出A17與A27相互作用的胺基酸片段以及專一性作用機制。
A17由203個胺基酸組成,其結構為N端無序纏繞( 1-60 )、四個疏水性穿越膜蛋白( 61-77、81-98、113-138和141-161 )與C端無序纏繞( 161-203 )。A27序列包含110個胺基酸,主要可分成四大不同功能的區域,1-42為無序纏繞結構,其中包括訊號序列與肝素結合位置,43-84為α螺旋捲曲螺旋區段,85-110為白胺酸拉鏈相似結構區塊。A17為膜蛋白易沉澱不利於蛋白質表現及純化,而A27本身具有自組裝成多聚體的特性,這些性質增加研究A17與A27相互作用的困難度,因此樣品設計為A17-N端(18-50)、A17-C端(162-203)及A17-S (18-50,其中24-34序列打亂)三片段,分別與A27進行一系列液態核磁共振實驗,從二維異核核磁共振實驗結果得知與A27
VI
相互作用區段為A17-N而非A17-C。從滴定A27之實驗結果證實A17-N與A27是兩階段式相互作用機制,參與第一階段作用區段主要為疏水性胺基酸(32-36),第二階為帶電荷胺基酸(20-27),此相互作用對於蛋白質序列順序(一級結構)具有專一性。此外,第二階段作用區段可能在不同pH值下受到調控,透過液態核磁共振及圓二色光譜的實驗結果發現不同pH值下,A17/A27並無明顯二級結構改變。
謝誌 IV
中文摘要 V
Abstract VII
第一章 緒論 1
1-1痘病毒相關介紹 1
1-1-1 痘病毒 ( Vaccinia virus ) 簡介與感染模式 1
1-1-2 痘病毒套膜蛋白 ( Envelop protein ) A27 3
1-1-3 痘病毒膜蛋白 ( Membrane protein ) A17 4
1-2 核磁共振 ( Nuclear Magnetic Resonance, NMR ) 9
1-2-1 核磁共振歷史背景 9
1-2-2 核磁共振基本原理 11
1-2-3 吸收機制 14
1-2-4 自由感應衰退 ( Free Induction Decay,FID ) 14
1-2-5 化學位移 ( Chemical shift ) 15
1-2-6 耦合效應 ( Coupling effect) 16
1-2-7 鬆弛機制 ( Relaxation ) 17
1-2-8 二維核磁共振光譜 18
1-2-9 異核單一量子相干核磁共振光譜(Heteronuclear Single Quantum Coherence spectroscopy,HSQC) 19
1-2-10三維異核核磁光譜循序判定 20
1-3-1 圓二色光譜原理 29
1-3-2 胜肽之二級結構分析 30
1-4 研究動機 33
第二章 材料與方法 34
2-1 痘病毒蛋白質製備 34
2-1-1 A17與A27質體 34
2-1-2蛋白質表現 35
2-1-3 蛋白質純化 36
2-1-4 蛋白質電泳分析 37
2-1-5 蛋白質二次純化 37
2-2 核磁共振儀 41
2-2-1 二維及多維核磁共振光譜 41
2-3 圓二色光譜儀測量蛋白質二級結構 42
第三章 結果與討論 43
3-1 痘病毒蛋白表現與鑑定之結果 43
3-2 核磁共振光譜分析 48
3-2-1 A17-N核磁共振光譜分析 48
3-2-2 二維光譜分析A17-N與A27之相互作用 49
3-2-3 化學位移差值A17-N二級結構分析 51
3-2-4 二維光譜分析A17-S與A27相互作用 52
3-2-5 A27與A17作用區段 53
3-3 圓二色光譜分析 72
3-3-1 A17-N與A27二級結構分析 72
第四章 結論 76
4-1 A17與A27相互作用 76
4-2 未來展望 77
參考文獻 79
【 附錄 】 82

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