臺灣博碩士論文加值系統

麥芽糖苷海藻糖生成酶 (Maltooligosyltrehalose synthase, MTSase) 能將麥芽寡糖進行分子內轉糖苷反應，使其還原端上的 α-1,4 糖苷鍵轉換成 α-1,1 鍵結，從而產生麥芽寡糖苷海藻糖 (maltooligosyltrehalose)，產物隨後再以麥芽糖苷海藻糖水解酶 (Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase) 水解並產生海藻糖 (trehalose)。本實驗主要是針對 Sulfolobus solfataricus ATCC 35092 的 treY 進行靜默突變，而突變的部分主要是將之突變成與鄭 (2010) 的嵌合基因 (chimeric genes) SA21-G107W/G131E 序列相類似，此外，亦會對該片段進行 codon 最適化，並探討是否能提升其 MTSase 蛋白質表現量與活性。利用 megaprimed QCM 與 RF cloning 的方式，將原生型 S. solfataricus ATCC 35092 的 treY 基因進行靜默突變，並成功獲得基因突變株 SS1、SS2、SS3、SS4 以及 SS5。以 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 作為表現宿主的突變株，除了 SS1 不需添加 IPTG 之外，SS2~SS5 的最適 IPTG 皆為 0.05 mM；分別將低溫培養以及添加 0.05 mM IPTG 誘導後的菌株進行 SDS-PAGE 膠電泳分析後可發現，前者以 SS2 和 SS5 所產生 MTSase 較多，而後者則為 SS4 以及 SS5。此外，於 20℃ 低溫培養後，以 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 作為表現宿主的菌株進行小量破菌，於統計分析後，SS3 所產之 MTSase 蛋白質含量與 SS4 沒有顯著差異但其他組別則有，在活性方面，原生型與突變株則無顯著差異。而於添加 0.05 mM IPTG 的組別，SS2 以及 SS4 的蛋白質含量較原生型、SS1 以及 SS5 低；此外，SS3、SS4、SS5 的活性，皆較原生型與 SS1 高。將以 E. coli Rosetta(DE3) 作為表現宿主的菌株，於添加 0.05 mM IPTG 誘導並進行小量破菌後，除了 SS2 以外，原生型與靜默突變株所產之 MTSase 蛋白質含量在統計上並無顯著差異，但突變株的活性卻較原生型高。此外，以 E. coli Rosetta(DE3) 作為表現宿主的菌株，於不添加 IPTG 並以 20℃ 低溫培養以及進行大量破菌後，SS4 與 SS5 的粗酵素液之活性皆較原生型高，此外，經過 80℃、2 小時熱處理後，SS4 的活性較原生型高。於 mRNA 二級結構預測方面，以 SS5 所改變的構型與原生型 S. solfataricus ATCC 35092 treY 差異最大，這可能是因為改變了 27 個核苷酸，使其原本的結構受到破壞；此外，也可能因將其改變成宿主較常用的 codon，使得結構看起來較為鬆散。

The maltooligosyltrehalose synthase (MTSase) has glucosyltransferase activity and converts the first α-1,4-glycosidic linkage at the reducing end into α-1,1 linkage to produce maltooligosyltrehalose, and the maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTHase) catalyses the hydrolytic release of trehalose from maltooligosyltrehalose. In order to improve the expression and activities of MTSase from S. solfataricus ATCC 33909, silent mutation had been used. Five silent-mutated were produced by mutating the SStreY genes sequence to be similar to chimeric gene of SA21-G107W/G131E, and displacing a partial sequence of SStreY gene to be codon which has higher usage frequencies in E. coli. The appropriate IPTG concentrations of silent-mutated MTSases in E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL were 0 mM for SS1 and 0.05 mM for SS2~SS5 respectively. According to the SDS-PAGE analysis, the expressions of MTSases of SS2 and SS5 were increased when cultivated at 20℃ for 20 hours, however, the expression of SS4 and SS5 were increased after induced by 0.05mM IPTG. After cultivated the silent-mutated at 20℃ for 20 hours, the MTSases expressions of SS3 and SS4 were decreased when the genes were expressed in E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL, but the activities of silent-mutated MTSases were significantly different to that of wild-type. When the genes were expressed in E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL, SS2 and SS4 are lower than wild type, SS1 and SS5, but the activities of SS3, SS4 and SS5 had higher than that of wild-type after induced by 0.05mM IPTG. The expression at 0.05mM IPTG for silent-mutated MTSases of SS4 and SS5 are increased when the gene were expressed in E. coli Rosetta(DE3), but the activities of SS1~SS5 were significantly different to that of wild-type. When SS4 and SS5 were expressed in E. coli Rosetta(DE3) without IPTG, the activities of SS4 and SS5 crude extract were higher than that of wild-type after treatment by French Press. After 2 hours heat treatment, the activities of SS5 was not significantly different to that of wild type excepted SS4. The SS5 mRNA secondary structure is different to that of wild-type, because SS5 had change 27 nucleic acids, which might destroy the secondary structure of wild-type, and might make the structure looser.

目錄 V
圖目錄 X
表目錄 XII
壹、前言 1
貳、文獻整理 4
一、海藻糖的簡介 4
1. 背景 4
2. 海藻糖的合成途徑 4
3. 熱穩定酵素轉換法生產海藻糖 5
4. 海藻糖的應用 6
二、麥芽寡糖苷海藻糖生成酶 7
1. 簡介 7
2. 轉糖基反應機制 7
3. Sulfolobus solfataricus ATCC 35092 與 Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909 之 MTSase 的比較 9
三、Codon 最適化與 mRNA 二級結構預測 10
1. 將表現基因改變成表現宿主較常用之 codon 10
2. mRNA 二級結構之預測與使用與軟體之簡介 11
四、基因選殖與蛋白質工程之相關研究 12
1. Restriction-Free (RF) cloning 12
叁、實驗流程設計 14
肆、材料與方法 16
一、實驗材料 16
1. 載體與菌株 16
1.1 treY 基因來源菌株 16
1.2 表現 treY 基因之質體 16
1.3 保存質體之菌株 16
1.3 蛋白質表現之系統菌株 16
2. 標準品 16
2.1 DNA 標準品 (Marker) 16
2.2 蛋白質標準品 (Marker) 16
3. 酵素 17
3.1 聚合酶 17
3.2 限制酶 17
4. 培養基材料 17
5. 抗生素 17
6. 市售套組 17
7. 化學藥品 18
8. 實驗設備 19
9. 電腦軟體 20
二、實驗方法 21
1. 定點原生型 MTSase 基因後其表現載體的製備與轉形至表現宿主 21
1.1 宿主細胞與培養基之選擇 21
1.2 製備小量質體 DNA 21
1.3 製備熱休克勝任細胞 (E.coli DH5α) 22
1.4 熱休克轉型作用 (Heat shock transformation) 23
1.5 製備電穿孔勝任細胞 (E.coli BL-21(DE3)-Codon Plus-RIL) 23
1.6 電穿孔轉形作用 (electroporation) 24
1.7 序列分析 24
1.8 DNA 濃度之測定 25
1.9 LB 培養基之製備 25
1.10 TB 培養基之制備 25
1.11 菌種保存 25
2. 定點突變 25
2.1 設計定點突變 PCR 引子 26
2.2 定點突變引子之合成 27
2.3 突變 PCR 溶液組成及反應條件 27
2.3.1 第一階段 PCR 反應 27
2.3.2 第二階段 PCR 反應 28
2.3.3 Megaprimer 長度加長之條件 28
2.4 RF cloning 的反應條件 29
2.5 膠體電泳分析 30
2.6 膠純化 30
2.6.1 PCR 反應產物膠純化 30
2.6.2 洋菜膠體回收純化 PCR 反應產物 31
2.7 以 Dpn I 限制酶剪切 PCR 反應後之 dsDNA template 31
2.8 基因之保存 32
3. 突變後原生型 MTSase 之蛋白質表現與小量破菌 32
3.1 試驗宿主細胞所需 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 之最佳濃度 32
3.2 突變型 MTSase 之小量破菌 33
3.3 突變型 MTSase 之蛋白質表現 33
3.4 靜默突變後 MTSase 之細胞破碎 34
3.5 蛋白質定量 34
3.5.1 定量蛋白質之相關試劑的製備 35
3.6 蛋白質電泳分析 35
3.6.1 膠體成份 35
3.6.2 膠體製備 36
3.7 膠電泳之操作方法 37
3.7.1 膠片的染色與脫色 37
3.7.2 2X SDS sampling buffer 之製備 37
3.7.3 染色劑的製備 38
3.7.4 脫色劑的製備 38
4. 定點突變原生型 MTSase 熱處理後之活性測定 38
4.1 活性定義 38
4.1.1 製備 DNS 試劑 (DNS-reagent) 38
4.2 以 DNS 法測麥芽寡糖苷海藻糖生成酶之轉糖苷活性 39
4.2.1 DNS 法原理 39
5. RNAstructure 5.3 操作流程 39
伍、結果與討論 41
1. 基因比對與引子設計 41
2. SS treY 基因之靜默突變與基因 codon 最適化 42
2.1 利用 megaprimed QCM 將 SStreY 基因進行靜默突變 42
2.2 利用 RF cloning 將 SStreY 基因進行 codon 最適化 . 43
2.3 靜默突變株之最適 IPTG 濃度測試 43
3. 靜默突變株之最適 IPTG 濃度測試 43
4. 破菌後 MTSase 蛋白質含量與活性之測定 44
4.1 小量破菌後 MTSase 蛋白質含量與活性之測定 44
4.2 大量破菌後 MTSase 活性之測定 45
5. 原生型 MTSase 與靜默突變株之 mRNA 二級結構預測 46
陸、結論 48
柒、參考文獻 50

圖目錄
圖一、海藻糖之結構 57
圖二、麥芽寡糖經 MTSase 與 MTHase催化之二次降解流程 58
圖三、利用區塊交換方式所產生之突變基因產物示意圖 59
圖四、原生型 SS MTSase 與重組型 SA21 MTSase-G107W/G131E 之序列比對 60
圖五、原生型 SS MTSase 局部基因在有無密碼最適化之序列比對 61
圖六、Megaprimed QCM 之流程 62
圖七、RF cloning 示意圖 63
圖八、電泳分析第一階段之 PCR 產物 64
圖九、電泳分析第二階段之 PCR 產物 65
圖十、SS5 之 DNA 電泳分析圖 66
圖十一、SS1、SS2 與 SS3 之自動核苷酸序列分析部分圖譜 67
圖十二、SS4 之自動核苷酸序列分析部分圖譜 68
圖十三、SS5 之自動核苷酸序列分析部分圖譜 69
圖十四、各轉型株於 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 中在不同 IPTG 濃度之 MTSase 表現 70
圖十五、以 SDS-PAGE 分析原生型與靜默突變型基因於低溫培養後之 MTSase 表現 71
圖十六、以 SDS-PAGE 分析原生型與靜默突變型基因於 0.05mM IPTG 誘導後之 MTSase 表現 72
圖十七、各轉形株於 E. coli Rosetta (DE3) 中在不同 IPTG 濃度之 MTSase 表現 73
圖十八、以 SDS-PAGE 分析原生型與靜默突變型基因於 0.05mM IPTG 誘導後之 MTSase 表現 74
圖十九、原生型 S. acidocaldarius ATCC 33909 treY 基因之 mRNA 二級結構 75
圖二十、原生型 S. solfataricus ATCC 35092 treY 基因之 mRNA 二級結構 76
圖二十一、靜默突變株 SS1 之 mRNA 二級結構 77
圖二十二、靜默突變株 SS2 之 mRNA 二級結構 78
圖二十三、靜默突變株 SS3 之 mRNA 二級結構 79
圖二十四、靜默突變株 SS4 之 mRNA 二級結構 80
圖二十五、靜默突變株 SS5 之 mRNA 二級結構 81
圖二十六、以 DNS 法測定麥芽五糖濃度之標準曲線 82
圖二十七、蛋白質含量分析之標準曲線 83

表目錄
表一、定位突變 PCR 之引子組序列 84
表二、RF cloning PCR 之引子組序列 85
表三、延長 PCR 引子之序列 86
表四、原生型及突變之 treY 定序分析之引子組 87
表五、以 20℃ 培養大腸桿菌 BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 產生原生型與靜默突變型 MTSase 之活性、粗蛋白與比活性比較表 88
表六、以 0.05mM IPTG 誘導大腸桿菌 BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 產生原生型與靜默突變型 MTSase 之活性、粗蛋白與比活性比較表 89
表七、以 0.05mM IPTG 誘導大腸桿菌 Rosetta(DE3) 產生原生型與靜默突變型 MTSase 之活性、粗蛋白與比活性比較表 90
表八、以 20℃ 培養大腸桿菌 Rosetta(DE3) 產生原生型與靜默突變型 MTSase 之活性比較表 91

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