臺灣博碩士論文加值系統

生質酒精(Bioethanol)係屬於再生能源(renewable energy)，目前發展趨勢之一為纖維酒精(cellulosic ethanol)之開發。基於環境保護(environmental protection)與資源之妥善利用等立場，欲開發高鹽含量之農產加工廢棄物、低度利用之海洋資源及鹽鹼化土地所種植之作物等產製纖維酒精，則製程中則需應用具耐鹽性之酒精發酵酵母菌。
本研究於2010年6月間，分別於台灣北部地區採集甜味種楊桃醃漬液，中部地區採集酸味種楊桃醃漬液及酸菜醃漬液。利用YPD固態培養基將醃漬液中之酵母菌株進行分離及純化後，共得168株酵母菌分離株。利用漸進式鹽度篩選及酒精生成呈色試驗篩選出59株酵母菌分離株，進行培養及細胞形態之觀察，並由各醃漬分離株中隨機選取十數株以26S rDNA之D1/D2區域進行定序鑑定，將其序列與National Center for Biotechnology Information (NCBI)之GenBank資料庫進行比對，結果顯示所得之分離菌株屬於Wickerhamomyces、Pichia及Candida屬。其中與Pichia subpelliculosa序列相似度高達99%之酵母菌分離株tiger 3，以高效液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography)分析酒精生成之能力為分離株中最佳者，並進一步探討其分離株之生理生化特性與最適之酒精發酵環境試驗。於酒精發酵之環境試驗結果中得知tiger 3之最適發酵溫度為30℃，最適發酵鹽度為7%。於上述環境下之最適發酵pH值為7，其發酵96小時之酒精生成量為28.16 ± 0.76 g/L。故欲構築tiger 3為利用含鹽物料之纖維酒精菌株，其製程設計較適合併用氨水前處理。研究結果顯示tiger 3為一極具發展潛力之纖維酒精發酵酵母菌株。

Lignocellulosic biomass is recognized as potentially sustainable source for the production of bioethanol, this innovative technology based on cellulosic biomass bioconversion to ethanol requires feedstock and microbial process. There are some agricultural processing residues, marine resources and saline crops with highly salt concentration, which are the potential as a feedstock if we want to use these kinds of material to produce cellulosic ethanol, we certainly need to find yeast strain which could tolerant high salt concentration.
168 yeast strains were isolated from three different kind of pickled liquid in Brassica juncea, sweet carambola, sour carambola, and respectively. 59 isolates were selected through progressive salt concentration assay and enzymatic screening of ethanol production assay. About 10 to 20 isolates randomly picked from each pickled liquids according to their analysis of 26S rDNA D1/D2 domain sequence by NCBI GenBank, these strains could belong to Candida, Pichia, Wickerhamomyces respectively.
Tiger 3, identity index was 99% with Pichia subpelliculosa, which shows the greatest ethanol production ability by HPLC. Also the physiological and biochemical characteristics of tiger 3 were measured. In the experiment of optimal alcohol fermentation conditions, the optimal temperature is 30℃, the optimal salt concentration is 7%. Under those conditions, the optimal fermentation pH value is 7, the ethanol production is 28.16 ± 0.76 g/L after 96 hours fermentation period.

口試委員審定書 i
謝誌 ii
中文摘要 iii
Abstract iv
目錄 v
圖目錄 vii
表目錄 xi
第一章 前言 1
第二章 文獻回顧 2
第一節 生質能源 2
第二節 生質酒精 3
第三節 纖維酒精 10
第四節 酵母菌 26
第五節 楊桃醃漬液 32
第六節 酸菜醃漬液 36
第七節 研究架構 40
第三章 材料方法 41
第一節 樣本採集 41
第二節 藥品試劑 42
第三節 儀器設備 43
第四節 酵母菌分離純化 44
第五節 漸進式鹽度篩選 44
第六節 酒精生成力試驗 45
第七節 以分子生物學之技術鑑定酵母菌分離株 49
第八節 以傳統形態學之技術鑑定酵母菌分離株 52
第九節 tiger 3之生理生化試驗 53
第十節 tiger 3之酒精發酵試驗 54
第四章 結果與討論 55
第一節 酵母菌分離純化 55
第二節 漸進式鹽度篩選 57
第三節 酒精生成力試驗 60
第四節 以傳統型態學之技術鑑定酵母菌分離株 65
第五節 以分子生物學之技術鑑定酵母菌分離株 69
第六節 tiger 3之生理生化試驗 72
第七節 酒精發酵試驗 75
第五章 結論 120
參考文獻 122
附錄1、sweet 4與Wickerhamomyces anomalus之26S rDNA D1/D2區域序列比對 127
附錄2、tiger 3與Pichia subpelliculosa之26S rDNA D1/D2區域序列比對 129
附錄3、tiger 3與Pichia subpelliculosa之18S rDNA部分區域序列比對 131
附錄4、open 20與Candida etchellsii之26S rDNA D1/D2區域序列比對 136
附錄5、open 39與Candida apicola之26S rDNA D1/D2區域序列比對 138

圖目錄
圖 1、碳循環 3
圖 2、纖維酒精製作程序及常見之程序整合 15
圖 3、纖維素分解酵素將纖維素水解為葡萄糖之情形 19
圖 4、SHF程序簡圖 21
圖 5、SSF程序簡圖 23
圖 6、SSCF程序簡圖 24
圖 7、CBP程序簡圖 25
圖 8、酵母菌細胞結構 27
圖 9、酵母菌轉換葡萄糖生成酒精之代謝路徑 28
圖 10、Saccharomyces cerivisiae之酒精、甘油及海藻糖代謝路徑 29
圖 11、酵母菌在高滲透壓及低滲透壓環境之反應 30
圖 12、酵母菌及細菌代謝木糖形成酒精之路徑 31
圖 13、發酵楊桃果汁工業化生產加工流程圖 34
圖 14、實驗架構 40
圖 15、高效液相層析儀之葡萄糖檢量線 47
圖 16、高效液相層析儀之乙醇檢量線 47
圖 17、高效液相層析儀之丙三醇檢量線 48
圖 18、18S-26S核醣體DNA之簡圖 49
圖 19、實驗所採集之醃漬液種類及其代號 55
圖 20、以塗佈法及劃線法由各醃漬液中取得純化之分離菌株 56
圖 21、以96孔盤進行漸進式鹽度篩選 59
圖 22、以酵素法檢測酒精之呈色試驗結果 61
圖 23、甜味種楊桃醃漬液之酵母菌分離株培養液之酒精生成情形 62
圖 24、酸味種楊桃醃漬液之酵母菌分離株培養液之酒精生成情形 63
圖 25、酸菜醃漬液之酵母菌分離株培養液之酒精生成情形 64
圖 26、tiger 3於顯微鏡下觀察之細胞形態 67
圖 27、tiger 3於掃描式電子顯微鏡下之觀察 68
圖 28、tiger 3於好氧環境中之生長曲線 72
圖 29、tiger 3於30℃環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 76
圖 30、tiger 3於37℃環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 77
圖 31、tiger 3於42℃環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 78
圖 32、tiger 3於不同溫度厭氧發酵下生長情形之比較 79
圖 33、tiger 3於不同溫度厭氧發酵下葡萄糖消耗情形之比較 80
圖 34、tiger 3於不同溫度厭氧發酵下酒精生成情形之比較 81
圖 35、tiger 3於不同溫度厭氧發酵下甘油生成情形之比較 82
圖 36、tiger 3於0%鹽度下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 85
圖 37、tiger 3於7%鹽度下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 86
圖 38、tiger 3於10%鹽度下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 87
圖 39、tiger 3於15%鹽度下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 88
圖 40、tiger 3於不同鹽度厭氧發酵下生長情形之比較 89
圖 41、tiger 3於不同鹽度厭氧發酵下葡萄糖消耗情形之比較 90
圖 42、tiger 3於不同鹽度厭氧發酵下酒精生成情形之比較 91
圖 43、tiger 3於不同鹽度厭氧發酵下甘油生成情形之比較 92
圖 44、tiger 3於pH 2不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 95
圖 45、tiger 3於pH 3不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 96
圖 46、tiger 3於pH 4不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 97
圖 47、tiger 3於pH 5不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 98
圖 48、tiger 3於pH 6不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 99
圖 49、tiger 3於pH 7不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 100
圖 50、tiger 3於pH 8不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 101
圖 51、tiger 3於不含鹽環境中不同pH值厭氧發酵之生長情形比較 102
圖 52、tiger 3於不含鹽環境中不同pH值厭氧發酵之葡萄糖消耗情形比較 103
圖 53、tiger 3於不含鹽環境中不同pH值厭氧發酵之酒精生成情形比較 104
圖 54、tiger 3於不含鹽環境中不同pH值厭氧發酵之甘油生成情形比較 105
圖 55、tiger 3於pH 3鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 108
圖 56、tiger 3於pH 4鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 109
圖 57、tiger 3於pH 5鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 110
圖 58、tiger 3於pH 6鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 111
圖 59、tiger 3於pH 7鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 112
圖 60、tiger 3於pH 8鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 113
圖 61、tiger 3於pH 9鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 114
圖 62、tiger 3於鹽度7%環境中不同pH值厭氧發酵之生長情形比較 115
圖 63、tiger 3於鹽度7%環境中不同pH值厭氧發酵之葡萄糖消耗情形比較 116
圖 64、tiger 3於鹽度7%環境中不同pH值厭氧發酵之酒精生成情形比較 117
圖 65、tiger 3於鹽度7%環境中不同pH值厭氧發酵之甘油生成情形比較 118

表目錄
表 1、巴西2003-2010輕型雙燃料汽車之生產情形 6
表 2、常見木質纖維素原料之組成分析 12
表 3、以不同料源轉化生質酒精產量之比較 13
表 4、楊桃醃漬液與酸菜醃漬液之採集狀況 41
表 5、HPLC之分析條件 46
表 6、本實驗所選用之PCR引子 50
表 7、以NL1、NL4為引子之PCR條件 50
表 8、以NS1、NS6為引子之PCR條件 51
表 9、各醃漬液之鹽度與pH值分析 56
表 10、由各醃漬液中所挑選之酵母菌分離株數 56
表 11各醃漬液分離株之漸進式鹽度篩選情形 59
表 12、各醃漬液之酵母菌分離株在形態學上之觀察情形 67
表 13、各醃漬液分群代表之酵母菌分離株定序結果 71
表 14、tiger 3之碳氮源利用情形 74
表 15、tiger 3於30℃環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 76
表 16、tiger 3於37℃環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 77
表 17、tiger 3於42℃環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 78
表 18、tiger 3於不同溫度厭氧發酵下O.D.值與甘油濃度之比值 83
表 19、tiger 3於0%鹽度下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 85
表 20、tiger 3於7%鹽度下的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 86
表 21、tiger 3於10%鹽度下的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 87
表 22、tiger 3於15%鹽度下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 88
表 23、tiger 3於不同鹽度厭氧發酵下O.D.值與甘油濃度之比值 93
表 24、tiger 3於pH 2不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 95
表 25、tiger 3於pH 3不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 96
表 26、tiger 3於pH 4不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 97
表 27、tiger 3於pH 5不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 98
表 28、tiger 3於pH 6不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 99
表 29、tiger 3於pH 7不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 100
表 30、tiger 3於pH 8不含鹽環境下發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 101
表 31、tiger 3於不含鹽環境中不同pH值厭氧發酵下O.D.值與甘油濃度之比值 106
表 32、 tiger 3於pH 3鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 108
表 33、tiger 3於pH 4鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 109
表 34、tiger 3於pH 5鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 110
表 35、tiger 3於pH 6鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 111
表 36、tiger 3於pH 7鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 112
表 37、tiger 3於pH 8鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 113
表 38、tiger 3於pH 9鹽度7%環境發酵過程中的葡萄糖、酒精及甘油變化情形 114
表 39、tiger 3於含7%鹽度環境中不同pH值厭氧發酵下O.D.值與甘油濃度之比值 119

方祖達、李穎宏。2005。園藝產品(醃漬類)。臺灣農家要覽。765-776。
王武彰。1994。著果部位對楊桃產量與品質之影響。中華農業研究。41:261-270。
江佩娣。2007。酸菜加工作業方式改善及廢棄物減量研究。國立台灣大學食品科技研究所碩士論文。
吳耿東、李宏台。2007。全球生質能源應用現況與未來展望。林業研究專訊。14(3):5-9。
李清福、李君昱、韓建國。1996。通氣對楊桃汁發酵過程中菌相變化之研究。元培學報。3:87-94。
李福臨。2003。微生物分類與鑑定之發展近況。食品工業。35(7):4-17。
林佑生、李文乾。生質酒精。科學發展。433: 20-25。
許明仁。2005。園藝產品(果汁類) 。臺灣農家要覽。719-740。
陳文恆、郭家倫、黃文松、王嘉寶。2007。纖維酒精技術之發展。農業生技產業季刊。9:62-69
陳明正、毛宗賢。1992。大埤鄉特產品-芥菜產製銷。台南地區農業專訊。1:20-22。
曾益民。2007。生質酒精汽油之發展。永續產業資訊雙月刊。35: 22-31。
黃怡靜。2005。大埤鄉芥菜加工業之產銷空間研究-以興安村為例。國立嘉義大學史地學研究所碩士論文。
楊淑惠、王惠亮、王武彰。1995。酸味種楊桃醃漬過程中有基酸及醣類變化之研究。中華農業研究。44(2):135-146。
楊淑惠、王惠亮。1996。酸楊桃接菌式發酵之研究。中華農業研究。45(4):393-400。
葉連德。2010。以鹽馴養酵母菌在白吐司及饅頭製程上之應用。國立屏東科技大學食品科學系博士論文。
廖春梅。2010。生質酒精之經濟效益分析。台灣銀行季刊。61(2):163-190。
劉碧鵑。2005。楊桃。臺灣農家要覽。149-154。
蔡榮哲。1995。傳統式楊桃汁加工醃漬過程中品質與化學成分及菌相之研究。國立臺灣大學園藝學研究所博士論文。
薛聰賢。2000。芥菜類。台灣蔬果食用百科。1:42
蘇俊權。1991。酸菜醃漬過程中酵母菌之分離及其特性之鑑定。國立中興大學食品科學研究所碩士論文。
Aiello, C.; A. Ferrer; A. Ledesma. 1996. Effect of alkaline treatments at various temperatures on cellulase and biomass production using submerged sugarcane bagasse fermentation with Trichoderma reesei QM 9414. Bioresource Technology, 57:13-18.
Appels, R., W. L. Gerlach, E. S. Dennis, H. Swift, W. J. Peacock. 1980. Molecular and chromosomal organization of DNA sequence coding for the ribosomal RNAs in cereals. Chromosoma, 78:293-311.
Arantes, V., Saddler, J. N. 2010. Access to cellulose limits the efficiency of enzymetic hydrolysis: the role of amorphogenesis. Biotechnology for Biofuels, 3:4.
Christoph, H., Katrin, M., Antonio, D. 2006. Mechanical stresses in cellular structures under high hydrostatic pressure. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 7:1-12.
Den Haan, R., Rose, S. H., Lynd, L. R., van Zyl, W. H. 2007. Hydrolysis and fermentation of amorphous cellulose by recombinant Sacchromyces cerevisiae. Metab. Eng., 9(1): 87-94.
Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. 2003. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology, 13:17-27
Fell, J.W., Boekhout, T., Fonseca, A., Scorzetti, G., Statzell-Tallman, A. 2000. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit r-DNA D1/D2 domain sequence analysis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50:1351-1371.
Hogsett, D. A., Ahn, H. J., Bernardez, T. D., South, C. R., Lynd, L. R. 1992. Direct microbial convertion: Prospect, progress, and obstacles. Appl. Biochem. Biotech., 34-35: 527-541.
Jacobs, C.J., Prior, B.A., Dekock M.J. 1983. A rapid screening method to detect ethanol production by microorganisms. Journal of Microbiological Methods, 1: 339-342.
Kim, Y. H., Lee, Y. Y., Sunwoo, C., Kim, J. S. 2006. Pretreatment of corn stover by low-liquid ammonia recycle percolation process. Appl. Biochem. Biotech., 133(1): 41-57.
Linder, C.R., Goertzen, L.R., Heuvel, B.V., Francisco-Ortega, J., Jansen, R.K. 2000. The complete external transcribed spacer of 18S-26S rDNA: amplification and phylogenetic utility at low taxonomic levels in asteraceae and closely allied families. Molecular Phylogenetics and Evolution, 14(2): 285-303.
Lowford, H. G., Rousseau, J. D. 1998. Improving fermentation performance of recombinant Zymomonas in acetic acid-containing media. Appl. Biochem. Biotech., 70-72: 161-172.
Lynd, L. R., van Zyl, W. H., MacBride, J. E., Laser, M. 2005. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: An update. Current Opin. Biotechnol., 16(5): 577-583.
Matsushika, A., Inoue, H., Kodaki, T., Sawayama, S. 2009. Ethanol production from xylose in engineered Saccharomyces cerevisiae strains: current state and perspectives. Appl. Microbio. Biotech. 84: 37-53.
McMillan, J. D., Newman, M. M., Templeton, D. W., Mohagheghi, A. 1999. Simultaneous saccharification and cofermentation of dilute-acid pretreated yellow poplar hardwood to ethanol using xylose-fermenting Zymomonas mobilis. Appl. Biochem. Biotech., 77-79: 649-665.
Middelhoven, W.J. 2002. Identification of yeast present in sour fermentation foods and fodders. Molecular Biotechnology, 21,279-292.
Mills, D.A., Johannsen, E.A., Cocolin, L. 2002. Yeast diversity and persistence in botrytis-affected wine fermentations. Applied and Environmental Microbiology, 68,4884-4893.
Philippidis, G. P., Smith, T. K. 1995. Limiting factors in the simultaneous sacchrification and fermentation process for conversion of cellulosic biomass to fuel ethanol. Appl. Biochem. and Biotech., 51/52:117-124.
Philippidis, G. P., Smith, T. K., Wyman, C. E. 1993. Study of the enzymatic hydrolysis of cellulose for production of fuel ethanol by the simultaneous ssacchrification and fermentation process. Biotechnol. Bioeng., 41(9):846-853.
Ray, B. 2006. Fundamental food microbiology. CRC Press.
Saadoun, I. 2002. Isolation and characterization of bacteria from crude petroleum oil contaminated soil and their potential to degrade diesel fuel. Journal of Basic Microbiology, 42, 420-428.
Saha, B. C. 2003. Hemicellulose bioconversion. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 30:279-291.
Sun, Y. and J. Y. Cheng. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, 83:1-11.
Taherzadeh, M. J., Karimi, K. 2007. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review. BioResourse, 2(4):707-738.
Teixeira, L. C., Linden, J. C., Schroeder, H. A. 2000. Simultaneous saccharification and cofermentation of peracetic acid-pretreated biomass. Appl. Biochem. Biotech., 84-86: 111-127.
Tengborg, C. 2000. Bioethanol Production: Pretreatment and Enzymatic Hydrolysis of Softwood. Ph.D. Tesis, Lund University, Sweden.
Van Dijken, J. P., Scheffers, W. A. 1986. Redox balances in the metabolism of sugars by yeasts. FEMS Microbiol. Rev. 32: 199-224.
Vasilakoglou, I., Dhima, K., Karagiannidis, N., Gatsis, T. 2010. Sweet sorghum productivity for biofuels under increased soil salinity and reduced irrigation. Field Cro-
ps Research, 120: 38-46.
Williams, C. M. J., Biswas, T.K., Schrale, G., Virtue, J.G., Heading, S. 2008. Use of saline land and wastewater for growing a potential biofuel crop (Arundo donax L). Irrigation Australia 2008 conference papers.
Wu, Z., Wang, X.R., Blomquist, G. 2002. Evaluation of PCR primers and PCR conditions for specific detection of common airborne fungi. Journal of Environmental Monitoring, 4,377-382.
Wyman, C. E. 1996. Handbook on Bioethanol: Production and Utilization. Washington, DC, Taylor & Francis.