臺灣博碩士論文加值系統

小耳症是顱顏整形外科臉部畸形之其中一種常見症狀，小耳症影響範圍主要是外耳缺陷、內耳耳道狹窄或缺少耳道等耳朵缺損情形，造成耳道閉鎖及聽力障礙問題。然而目前臨床上小耳症患者耳朵重建手術包括自體移植及人工義耳之植入，但採用自體移植受限於身上可移植軟骨之部位會造成缺損，而採用人工義耳植入術但易因植入骨釘位置、角度或深度不準確發生免疫排斥問題而造成病人術後之感染。近年來，組織工程技術已可利用具生物相容性之生醫材料製作人體耳朶外型之支架，再加入自體軟骨細胞培養成耳朵植入物，以解決前述問題；但是如何在生物相容性材料所製作之支架上快速培養出適質、適量之軟骨細胞，便成為組織工程臨床應用成功之重要關鍵；本研究團隊過去曾利用聚己內酯(Polycaprolactone, PCL)製作孔洞支架，並透過明膠及第二型膠原蛋白進行表面改質，以增加親水性、改善細胞貼附性，實驗證實已可成功地在PCL支架上培養出軟骨細胞。然而，臨床上常用之生物相容性材料為聚乳酸和聚甘醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)，因此本研究將延用前述表面親水性改質技術，改以PLGA材料製作圓柱形孔洞支架，再利用體外細胞培養與動物體內實驗，以驗證表面改質確實能發揮細胞在立體孔洞支架上貼附、增生及細胞外基質分化之效果。除此，本研究也建構了電磁攪拌式動態細胞培養平台，以評估動態培養對軟骨細胞在孔洞支架內增生以及細胞外基質分化之成效。
本研究第一部分工作係使用PLGA材料作為支架原料，以間接成型(Indirect Modeling)技術及鹽析法製作具有三維結構之軟骨孔洞支架，再添加第二型膠原蛋白進行表面改質。改質前後之孔洞支架也以SEM觀察支架微結構是否具有多孔性結構且孔洞相連，結果顯示孔洞大小介於300-500 μm之間，符合文獻指出之軟骨細胞貼附增生條件；另外，透過支架抗壓強度測試，也發現改質前後之支架其抗壓強度分別為1.740323± 0.659 MPa及3.113722± 0.331 MPa，改質後增強了79 %，兩者具有顯著差異(p<0.05)；至於孔洞支架接觸角量測結果方面，改質前後之接觸角從117.18± 3.32°降低至75.20± 9.40°(降低41.98°) ，不但改質前後兩者具有顯著差異(p<0.05)外，也證實添加第二型膠原蛋白表面改質確實可將孔洞支架疏水性表面改變為親水性表面。至於本研究細胞培養所須之軟骨細胞係從豬膝蓋上取得，並分別植入未經表面改質及經添加第二型膠原蛋白表面改質之支架，進行MTT (3- (4,5- cimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide )驗證細胞貼附之成效，結果發現其細胞貼附率經過一天後為84 %；細胞存活率定性分析(live and dead assay) 實驗結果也顯示改質後之細胞增生情形良好；另外，在葡萄糖胺聚合醣(Glycosaminoglycans, GAG )含量分析實驗結果發現，經過改質後比未改質之支架在軟骨細胞植入後培養八周，會由13.3881± 4.5697 μg增加到48.8709± 5.9481 μg，增加了35.4828 μg (265.03 %)，兩者具有顯著差異(p<0.05)；而第二型膠原蛋白含量之生成分析之實驗結果也發現改質前後會由7.2680± 1.3146 μg增加到23.8622± 14.1761 μg，增加了16.5942 μg (228.32 %)，兩者也有顯著差異 (p<0.05)。另外，在動物實驗方面，本研究也將附有軟骨細胞之支架植入裸鼠體內，並以實驗觀察細胞貼附與存活情形；在實驗八周後進行組織染色分析，結果證實改質後之支架確實可促進類軟骨細胞之增生與分化。本研究第二部分之工作係建構一種使用電磁攪拌方式產生之動態細胞培養平台，並進行靜、動態培養細胞增生實驗；由實驗21天後之結果發現，靜態培養之支架與動態培養之支架其細胞含量分別為173.4605± 22.7786及276.5724± 18.2784，顯示動態培養條件下細胞含量增加了103.1119 (59.44 %)，兩者具有顯著差異(p<0.05)；至於GAG含量分析結果之比較方面，靜態培養與動態培養所生成之GAG含量分別為169.1286± 6.5960 μg及182.5649± 18.1425 μg，表示動態培養條件下GAG含量之生成增加了13.4363 μg (7.94 %)，兩者具有顯著差異(p<0.05)。
本研究已完成利用PLGA材料製作出適合細胞生長之軟骨組織支架，經由添加第二型膠原蛋白表面改質後，以體外實驗及動物實驗，證實了表面改質後之支架確實具有提高細胞貼附、增生、分化效果。此外，本研究亦以實驗證明動態培養可加速細胞在支架內之增生及細胞外基質之分化效果。綜合以上研究結果，期望能對組織工程技術應用於人體軟骨組織(如耳朵)植入物之建構與再生有所助益。

Microtia, one of common symptom of craniofacial plastic surgery of facial deformity, main impact on absence of auricle, stricture of internal auditory canal or losing auditory canal or some else about absence of part of ear, and cause ankylotia and dysaudia. However, presently clinical microtia patients of reconstructive ear operation include autograft and artificial ear implantation, but autograft has limited by finite transplantable gristle and using artificial ear implantation operation will cause patients infection after an operation because a place, an angle or depth which bone peg implant in is not accurate and then immunologic rejection happen. Therefore, using tissue engineering, recently, manufacture an artificial ear has become an important developing tendency of plastic surgery of ear deformity operation treatment. However, external structure of artificial ears, cell adherent and proliferation and some else problems are the important project of using tissue engineering technique designing and manufacture artificial ears. Thus our research is using CAE to manufacture cartilage porosity scaffold by Rapid Prototyping technique and Particulate Leaching by compound biocompatibility material PLA and PLG and Type II Collagen, and also doing in vitro and in vivo cartilage proliferation and observing cells growing in dynamic cultivation.
Our research has two parts: First part is manufacture of cartilage tissue scaffold and in vitro and in vivo verification; Second part is setting up dynamic cultivation experimental installation and dynamic cultivation in vitro cells proliferation experiment. First part of research is using PLGA material to manufacture a scaffold. Use Indirect Modeling technique and Particulate Leaching to manufacture cartilage porosity scaffold which has three dimensional structure, and add Type II Collagen to surface modification. Measuring physical property of the scaffold include microcosmic structure assay by SEM observing cells scaffold microcosmic structure, structure strength assay and surface contact angle assay. When structure strength assay modify from 1.740323± 0.659 MPa to 3.113722± 0.331 MPa, it heighten 0.79 times and have remarkable difference (p<0.05), and contact angle of scaffold assay form 117.18± 3.32∘reduce to 75.20± 9.40 by modification. Reduce 41.98∘and has obviously difference (p<0.05), and change from hydrophobic to hydrophilic surface. Then get cartilage cells from pig knee, and then implant cartilage cells adding Type II Collagen scaffold, and then assay MTT (3- (4,5- cimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide ) cells activity, result of cells adherent, and live and dead rate on scaffold by assay Glycosaminoglycans (GAG) content. The cell adherent rate after one day is 84%, and GAG content assay modify after eight weeks increase from 110.7234± 36.4098μg to 330.7533± 48.4945μg that increase 220.0299μg. Furthermore, implant scaffold with cartilage cells into nude mice and observe the cell live and dead rate and adherent condition. After eight weeks, adding Type II Collagen scaffold or not, and assay tissue staining in two experiment conditions which is in vitro and in vivo. Second part in research is using dynamic cultivation installation of electromagnetic mixing to setting up dynamic cultivation installation and doing continued dynamic cultivation cells proliferation in vitro experiment, and then assay cells activity, live and death rate and content of GAG by MTT to assay cells proliferation in any conditions.
This research use PLGA material to manufacture porosity which is fit for cartilage tissue cells to growing and add Type II Collagen to surface modification. In vivo and in vitro experiment outcome verify that it can improve scaffold physical property and heighten cells proliferation. Moreover, this research is using dynamic cultivation installation to acceleration cells proliferation. Based on results obtained, we can expect that tissue engineering technique can improve microtia patients condition in future.

目錄
論文指導教授推薦書 i
論文口試委員審定書 ii
長庚大學博碩士紙本論文著作授權書 iii
誌謝 iv
中文摘要 v
英文摘要 viii
目錄 xi
圖目錄 xv
表目錄 xx
第一章 前言 1
1.1 研究背景與動機 1
1.2 研究目的 5
1.3 論文架構 6
第二章 文獻回顧 7
2.1 立體支架設計製造相關文獻 7
2.1.1 溶劑鑄造/鹽析法(Solvent Casting / Particulate Leaching) 7
2.1.2 冷凍乾燥法(Freeze Drying) 10
2.1.3 相分離法(Phase Separation) 11
2.1.4 氣體發泡法(gas foaming) 12
2.1.5 熔融沉積技術(Fused deposition modeling, FDM) 13
2.1.6 低溫沈積製造(Low-temperature deposition manufacturing) 14
2.1.7 雷射燒結快速成型法(Selected Laser Sintering) 15
2.1.8 三維列印法(3-dimensional printing) 19
2.1.9 仿生組織支架製作 20
2.2 組織支架表面改質相關文獻 21
2.2.1 明膠表面改質 21
2.2.2 第二型膠原蛋白表面改質 24
2.2.3 RGD序列表面改質 25
2.3 細胞再生實驗相關文獻 26
2.3.1 體內動物實驗 26
2.3.2 體外實驗 29
2.4 動態培養細胞增生相關文獻 29
2.4.1 力學刺激 29
2.4.2 振動刺激 32
2.5 文獻總結 33
第三章 研究架構與方法 35
3.1 簡介 35
3.2 軟骨組織支架製作體外實驗及動物實驗驗證 36
3.2.1 支架製作表面改質 36
3.2.2 支架物性測試 39
3.2.2.1 支架微結構分析 39
3.2.2.2 支架親水性分析 41
3.2.2.3 支架強度分析 42
3.2.3 體外實驗 44
3.2.4 化性測試 49
3.2.5 動物實驗 50
3.3 動態培養實驗平台設置及動態培養條件下細胞增生體外實驗驗證 51
3.3.1 動態培養實驗平台建置 51
3.3.2 體外實驗設計 52
3.3.3 實驗數據分析 53
第四章 結果與討論 54
4.1 簡介 54
4.2 軟骨組織支架製作體外實驗及動物實驗驗證結果與討論 54
4.2.1 支架製作表面改質結果與討論 54
4.2.2 支架物性測試結果與討論 55
4.2.2.1 支架微結構分析結果與討論 55
4.2.2.2 支架親水性分析結果與討論 58
4.2.2.3 支架強度分析結果與討論 62
4.2.3 體外實驗及化性測試結果與討論 63
4.2.3.1 細胞貼附率分析結果與討論 63
4.2.3.2 細胞存活率分析結果與討論 64
4.2.3.3 體外實驗GAG含量結果與討論 67
4.2.3.4 體外實驗第二型膠原蛋白含量結果與討論 71
4.2.4 動物實驗及化性測試結果與討論 73
4.2.4.1 動物實驗結果與討論 73
4.2.4.2 動物實驗之化性測試結果與討論 75
4.3 動態培養實驗平台設置及動態培養條件下細胞增生體外實驗結果與討論 79
第五章 結論與未來研究方向 83
參考文獻 85
附錄 90


圖目錄
圖一、小耳症程度分級示意圖 2
圖二、耳袋成形術示意圖 2
圖三、耳廓成形術示意圖 3
圖四、組織工程三要素示意圖 4
圖五、溶劑鑄造/鹽析法流程 7
圖六、DongChoon Sin之支架外觀圖 8
圖七、DongChoon Sin之支架SEM圖 8
圖八、Chun-Jen Liao鹽析法裝置 9
圖九、Chun-Jen Liao支架SEM圖 9
圖十、Nandana Bhardwaj冷凍乾燥法實驗流程 10
圖十一、Nandana Bhardwaj之支架SEM圖 10
圖十二、Yoon Sung Nam之PLGA支架SEM圖 11
圖十三、Yoon Sung Nam之PLLA支架SEM圖 11
圖十四、Leatrese Harris之氣體發泡法流程圖 12
圖十五、Leatrese Harris之支架SEM圖 13
圖十六、熔融層積成型 14
圖十七、熔融層積成型所製作之支架SEM圖 14
圖十八、低溫沈積製造 15
圖十九、低溫沈積製造所製作之支架圖 15
圖二十、雷射燒結快速成型法 16
圖二十一、Bin Duan之立體支架圖 16
圖二十二、Bin Duan之支架SEM圖 17
圖二十三、Szilvia Eosoly之PCL立體支架圖 17
圖二十四、Szilvia Eosoly之PCL支架SEM圖 18
圖二十五、W.Y. Yeong之支架外觀圖 18
圖二十六、W.Y. Yeong之支架SEM圖 19
圖二十七、三維列印法製造方式圖 20
圖二十八、三維列印法製作之支架 20
圖二十九、耳朵模具及支架圖 21
圖三十、Sio-Mei Lien明膠改質分層圖 22
圖三十一、Sio-Mei Lien之葡萄糖胺分泌量實驗結果 22
圖三十二、X. Wu明膠表面改質支架圖 23
圖三十三、X. Wu明膠表面改質支架SEM圖 23
圖三十四、E. Pfeiffer表面改質GAG含量 24
圖三十五、E. Pfeiffer表面改質應力測試 24
圖三十六、Chih-Sheng Ko表面改質之支架SEM圖 25
圖三十七、2D幾丁質薄膜添加RGD序列 26
圖三十八、3D幾丁質支架添加RGD序列 26
圖三十九、M.E. Casper軟骨組織截面圖 27
圖四十、M.E. Casper軟骨組織上視圖 27
圖四十一、Takashi Sato支架植入位置圖 28
圖四十二、Takashi Sato動物實驗後之支架 28
圖四十三、Huaping Tan支架之SEM圖 29
圖四十四、力量-位移曲線之比較圖 30
圖四十五、最大受力、勁度、最大應力及模數之比較圖 30
圖四十六、力學刺激後，(a)前膠原蛋白(b)脯氨酸及 31
圖四十七、Jeffrey C. Wolchok振動裝置類型一 32
圖四十八、Jeffrey C. Wolchok振動裝置類型二 32
圖四十九、Jeffrey C. Wolchok支架強度測試結果 33
圖五十、本研究架構圖 35
圖五十一、PLGA分子結構圖 37
圖五十二、支架製作流程圖 38
圖五十三、微觀結構分析流程 40
圖五十四、臨界點乾燥機實體圖 40
圖五十五、掃描式電子顯微鏡設備圖 41
圖五十六、接觸角量測儀 42
圖五十七、接觸角定義 42
圖五十八、Instron 5544 43
圖五十九、支架力學實驗圖 44
圖六十、細胞取樣流程 45
圖六十一、細胞來源-豬膝蓋 46
圖六十二、剝離非軟骨組織 46
圖六十三、浸泡軟骨細胞分離液 47
圖六十四、軟骨細胞離心純化 47
圖六十五、純化後之軟骨細胞 48
圖六十六、恆溫培養箱 48
圖六十七、動態培養平台設置流程 51
圖六十八、動態培養平台實體裝置 52
圖六十九、動態培養實驗流程圖 52
圖七十、動態與靜態細胞培養實驗條件比較圖 53
圖七十一、圓柱型支架圖 54
圖七十二、孔洞支架成品 55
圖七十三、PLGA-Type II collagen支架微觀結構 56
圖七十四、PLGA培養兩周之微觀結構 56
圖七十五、PLGA改質後培養二周之微觀結構 57
圖七十六、PLGA培養四周之微觀結構 57
圖七十七、PLGA改質後培養四周之微觀結構 58
圖七十八、PLGA實驗圖 59
圖七十九、PLGA-Gelatin實驗圖 59
圖八十、PLGA-Type II collagen實驗圖 60
圖八十一、三組支架親水性比較圖 61
圖八十二、三組支架強度比較圖 63
圖八十三、細胞貼附率 64
圖八十四、PLGA未改質支架細胞培養兩周後之confocal圖 65
圖八十五、PLGA改質後支架細胞培養兩周後之confocal圖 66
圖八十六、PLGA未改質支架細胞培養四周後之confocal圖 66
圖八十七、PLGA改質後支架細胞培養四周後之confocal圖 67
圖八十八、體外實驗細胞含量圖 68
圖八十九、體外實驗GAG總含量圖 69
圖九十、體外實驗每單位細胞GAG含量圖 70
圖九十一、體外實驗第二型膠原蛋白總含量圖 72
圖九十二、體外實驗每單位細胞第二型膠原蛋白含量圖 73
圖九十三、裸鼠實驗圖 74
圖九十四、動物實驗支架圖 74
圖九十五、PLGA改質後培養四周時Safranin O染色結果 75
圖九十六、PLGA改質後培養八周時Safranin O染色結果 75
圖九十七、PLGA培養八周時Safranin O染色結果 76
圖九十八、PLGA改質後培養四周時Alcine blue染色結果 76
圖九十九、PLGA改質後培養八周時Alcine blue染色結果 77
圖一百、PLGA培養八周時Alcine blue染色結果 77
圖一百零一、PLGA改質後培養四周時H&E染色結果 78
圖一百零二、PLGA改質後培養八周時H&E染色結果 78
圖一百零三、PLGA培養八周時H&E染色結果 79
圖一百零四、細胞含量比較圖 80
圖一百零五、GAG含量比較圖 82


表目錄
表1、三組支架表面接觸角量測值彙總表 60
表2、三組支架抗壓強度量測值彙總表 62
表3、細胞貼附率比較表 64
表4、體外實驗細胞含量實驗數據彙總表 68
表5、體外實驗GAG總含量實驗數據彙總表 69
表6、體外實驗每單位細胞GAG含量統計表 70
表7、體外實驗第二型膠原蛋白總含量實驗數據彙總表 71
表8、體外實驗每單位細胞第二型膠原蛋白含量數據統計表 72
表9、軟骨細胞增生實驗數據彙總表 80
表10、GAG分化實驗數據彙總表 81

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