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研究生:林毅忠
研究生(外文):Yi-Chung Lin
論文名稱:感染茉莉花之一種新carlavirus之鑑定及其與黃化病徵關係之探討
論文名稱(外文):Identification of a newly recognized carlavirus and its etiology of yellow mottling symptom on Jasmin
指導教授:張清安張清安引用關係
指導教授(外文):Chin-An Chang
學位類別:碩士
校院名稱:朝陽科技大學
系所名稱:生化科技研究所碩士班
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:100
語文別:中文
論文頁數:75
中文關鍵詞:茉莉花C病毒病毒鑑定黃化嵌紋病徵carlavirus茉莉花
外文關鍵詞:Jasmin virus CVirus identificationYellow mosaic symptomsCarlavirusJasmine
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茉莉花(Jasminum sambac)是台灣重要花卉植物之一,在觀賞或茶飲價值上都具有相當明顯之經濟重要性。彰化縣花壇鄉為茉莉花之主要產區,調查發現該地區茉莉花植株葉片普遍呈現黃化嵌紋病徵。然而中興大學附近與草屯所採集的茉莉花則無黃化斑點,但也帶有輕微嵌紋病微。本研究利用Potyvirus屬廣效性引子對(CIP)、Jasmin virus T (JaVT)專一性引子對(A-30)、Carlavirus屬廣效性引子對(Decarla)及JaVC專一性引子對 (Jacarla)等4組引子對進行檢測,結果發現黃化嵌紋病徵茉莉花均能被上述四組引子對增幅出符合預期之產物,但在輕微嵌紋病徵之茉莉花下卻只對CIP及A-30引子對增幅出產物,此結果顯示黃化嵌紋病徵之茉莉花至少含有JaVT及另一種Carlavrus之感染,而輕微嵌紋病徵之茉莉花樣品中則只感染JaVT。在電子顯微鏡觀察下,黃化嵌紋病徵之茉莉花樣品中可穩定發現長度在600-630 nm及700-730 nm等二種彎曲之長絲狀病毒顆粒,其中600-630 nm之粒子可能即PCR所增幅之Carlavirus病毒粒子。本研究利用前述之Carlavirus屬廣效性引子配合隨機引子(random primers)與RACE技術解析此Carlavirus屬病毒之序列,獲得一組長度達 8515 bp的完整病毒序列。與已登錄於GenBank之15種親緣接近之Carlavirus基因序列比對,在全長序列與各功能性轉譯區域(open reading frame, ORF)核苷酸相同度均低於68.5%,胺基酸相同度亦低於75.1%,依據國際病毒分類及命名原則,此一茉莉花上所發現之Carlaviru應屬一尚未被報導之新種病毒。此Carlavirus屬新病毒之基因體架構包含六個ORF與三基因重疊區(triple gene block, TGB),其中第 5 段ORF為外鞘蛋白轉譯區,此一基因體架構與Carlavirus屬病毒特性完全吻合。本研究也運用細菌表達載體技術大量生產此病毒之鞘蛋白,經SDS-PAGE分析估算其分子量為34 kDa。將細菌表現之鞘蛋白經兔子免疫注射生產抗體,於西方轉漬反應(Western blotting)、間接式酵素連結免疫吸附法(Indirect ELISA)及瓊脂雙向擴散反應(SDS-immunodiffusion test)下均能與其同源純化抗原反應,並對黃化嵌紋病徵之茉莉花樣品出現正反應,而與輕微嵌紋病徵茉莉花樣品並不產生任何反應,此一結果與應用本研究所解析之病毒序列設計專一性引子對進行RT-PCR檢測黃化嵌紋及輕微嵌紋病徵茉莉花樣品之結果完全吻合。綜合上述病毒形態大小、核酸序列分析、細胞病理學、血清學反應等種種證據,顯示本研究在黃化嵌紋病徵茉莉花上所發現之病毒確實為一Carlavirus屬新種病毒,故將其命名為茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)。並且根據上述檢測結果顯示JaVC之感染可能與茉莉花葉片黃化嵌紋病徵之產生有密切之相關。
Jasmine (Jasminum sambac) is one of the traditional ornamental crops in Taiwan. It has not only economic importance in aesthetic but also in tea beverage industry. Currently, Huatan Township of Changhua County is the major jasmine cultivation area in Taiwan. During the surveys conducted by our laboratory in recent years, we have found that most jasmine plants in Huatan area developed evident yellow mosaic symptoms on their leaves. However, we also found some jasmine plants in the campus of Chung Hsing University and in Tsaotun Township exhibited only very mild foliar mosaic but no yellowing symptoms. To clarify the etiology of the two different symptomatic jasmine, we used four different primer pairs including a Potyvirus generic primer pair (CIP), a Carlavirus generic primer pair (Decarla), a specific primer pair (A-30) to Jasmine virus T (JaVT), a potyvirus found in Taiwan infecting jasmine, and a specific primer (Jacarla) to a carlavirus found in jasmine in this study to react with those jasmine plants with different symptoms and found that all four primer pairs could amplify jasmines showing yellow mosaic symptoms; however, only the Potyvirus generic and JaVT specific primers could react with mild mosaic jasmines. This result indicated that jasmine plants with yellow mosaic symptoms were co-infected by potyvirus and carlavirus but the mild mosaic jasmine plants were singly infected only by potyvirus which was possibly JaVT. We also conducted electron microscopy studies on the jasmine samples with yellow mosaic symptoms and observed two types of filamentous virus particles with 600-630 nm and 700-730 nm in length, respectively, in the crude sap. Those particles with shorter length were possibly originated from the carlavirus infection as shown in the PCR results. Starting from the sequence of the fragment amplified by the Decarla primer, we had obtained the entire genome sequence of the carlavirus infecting Jasmine by random primer amplification and a commercial race kit. The complete genome of this jasmine carlavirus contained 8515 bp in length excluding the poly A tail. This genome structure encoded six open reading frames (ORFs) including three overlapping ones (ORF 2-4) similar to that reported as triple gene block of carlaviruses. The fifth ORF presumably encoded the coat protein gene of the virus. We compared this jasmine carlavirus genome sequence with other known carlaviruses in the GenBank and found that the highest nucleotide and amino acid sequence identities with other known carlavirus were lower than 68.5 and 75.1%, respectively. This result evidenced that this jasmine carlavirus was indeed a new carlavirus species based on virus species demarcation threshold of International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Therefore, we proposed to designate provisionally this new carlavirus from jasmine as Jasmin virus C (JaVC). In order to prepare antiserum against JaVC for the purpose of detection and identification, we took the approach of expressing the viral coat protein in bacteria using a commercial expression vector plasmid, pET-28b. The putative coat protein gene of JaVC was directionally cloned into the expressing vector and transformed into E. coli strain BL21. Protein expression was induced by the addition of IPTG into bacteria culture and the expressed 34 kDa coat protein was subsequently purified by preparative gel electrophoresis and used as immunogen to prepare antiserum in a rabbit. Reactivity of the antiserum was tested in SDS-immunodiffusion and indirect ELISA. Both serological tests showed that the antiserum could react strongly with its homologous antigens and field collected jasmine samples with yellow mosaic symptoms but not with jasmine plants bearing with only mild mosaic symptoms. This result corresponded to those obtained in RT-PCR amplification experiments using decarla and Jacarla primers. Based on these results the newly recognized carlavirus, JaVC, might involve in the development of foliar yellow mosaic symptom in jasmine plants.
目錄
摘要 I
英文摘要 III
誌謝 VI
目錄 VII
表目錄 XI
圖目錄 XII
壹、 前言 1
貳、 前人研究 4
一、 茉莉花屬之分類 4
二、 茉莉花(Jasminum sambac)之病蟲害記錄 4
三、 感染茉莉花屬病毒之種類與記錄 5
四、 Carlavirus之病毒特性 8
(一)、 病毒分類 8
(二)、 病毒顆粒之形態及基因架構 9
(三)、 病毒傳染及傳播特性 9
參、 材料與方法 11
一、 田間調查 11
(一)、 樣品採集 11
(二)、 病毒之來源與分離 11
(三)、 檢測茉莉花樣品 11
二、 病毒型態之觀察 12
三、 病毒基因序列之分析 12
(一)、 病毒序列定序 12
(二)、 專一性引子對之設計與RT-PCR檢測 20
四、 應用細菌表達載體技術製備病毒鞘蛋白 21
(一)、 設計可增幅病毒鞘蛋白全長基因序列之引子對 21
(二)、 限制酶處理與接合反應 21
(三)、 表現載體轉型於細菌(E. coli BL21) 21
(四)、 病毒鞘蛋白之分析 22
(五)、 表現蛋白之大量純化 23
(六)、 蛋白電泳回收 23
五、 抗血清之製備 23
(一)、 兔子進行免疫注射 24
(二)、 免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)之製備 24
六、 血清學反應 24
(一)、 瓊脂雙向擴散反應(SDS- immunodiffusion test) 25
(二)、 西方轉漬反應(Western blotting) 25
(三)、 間接式酵素連結免疫吸附法(Indirect ELISA) 26
肆、 結果 28
一、 田間調查 28
(一)、 樣品採集及病徵觀察之分級 28
(二)、 病毒之來源與分離及感染測試 28
(三)、 檢測茉莉花樣品之病毒種類 28
二、 病毒型態之觀察 29
三、 病毒基因序列之分析 29
(一)、 病毒基因序列解序策略 29
(二)、 核苷酸架構分析 30
(三)、 核苷酸序列比對 31
(四)、 專一性引子對之設計及樣品檢測 31
四、 細菌表達JaVC病毒鞘蛋白之分析 32
(一)、 細菌表達載體JaVC病毒鞘蛋白之構築 32
(二)、 細菌表達載體JaVC病毒鞘蛋白之分析 32
(三)、 西方轉漬反應 32
五、 JaVC鞘蛋白抗體之製備及瓊脂雙向擴散反應分析 33
六、 間接式酵素連結免疫吸附法 33
(一)、 不同免疫球蛋白濃度之Indirect ELISA反應測試 33
(二)、 田間樣品之Indirect ELISA反應測試 34
伍、 討論 35
陸、 參考文獻 40
柒、 附錄 43


表目錄
表一、 茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)全長基因體轉譯功能區域與其它15 個親緣關係較近之carlaviruses之對應轉譯功能區域之核苷酸相同度比較 45
表二、 茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)全長基因體轉譯功能區域與其它15 個親緣關係較近之carlaviruses之對應轉譯功能區域之胺基酸相同度比較 46


圖目錄
圖一、 彰化地區所發現呈現葉部黃化嵌紋病徵之茉莉花植株 47
圖二、 中興大學校園內所採集呈現輕微嵌紋但無黃化病徵之茉莉花葉片 47
圖三、 田間調查所發現之三種不同嚴重程度之茉莉花葉片黃化嵌紋病徵 48
圖四、 利用Carlavirus屬廣效性引子對(Decarla)進行RT-PCR檢測經接種黃化嵌紋茉莉花病葉的煙草(Nicotiana tabacum)及奎藜(Chenopodium quinoa) 49
圖五、 利用Carlavirus屬廣效性引子對進行RT-PCR檢測田間呈現黃化嵌紋及輕微嵌紋之茉莉花樣品 50
圖六、 利用Potyvirus屬廣效性引子對進行RT-PCR檢測田間呈現黃化嵌紋及輕微嵌紋之茉莉花樣品 51
圖七、 利用針對茉莉花T病毒(Jasmin virus T, JaVT)之專一性引子對進行RT-PCR檢測田間呈現黃化嵌紋及輕微嵌紋之茉莉花樣品 52
圖八、 黃化嵌紋茉莉花葉片粗萃汁液以穿透式電子顯微鏡放大40,000倍所觀察之病毒顆粒影像 53
圖九、 嚴重黃化嵌紋病徵茉莉花樣品上所增幅出之新種carlavirus (JaVC)之全長基因體架構及與增幅過程各片段之增幅引子相對位置與長度示意圖 54
圖十、 茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)之全長基因體(8,515 bp)核苷酸與胺基酸序列。藍色線乃標示六種(1-6)主要蛋白轉譯區域 (ORFs) 55
圖十一、 茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)與其它15 個親緣較接近之carlaviruses間親緣關係演化樹 65
圖十二、 利用針對茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)之專一性引子對(Jacarla)進行RT-PCR檢測田間呈現黃化嵌紋及輕微嵌紋之茉莉花樣品 67
圖十三、 利用含Nco I與Xho I限制酶切位之引子對(JaCPp-up及JaCPp-down)針對茉莉花黃化嵌紋病徵樣品進行RT-PCR反應之結果 69
圖十四、 細菌表達茉莉花C病毒(JaVC)病毒鞘蛋白基因載體之構築流程 70
圖十五、 應用膠體電泳(SDS-PAGE)及西方轉漬(Western blotting)分析細菌表現茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)鞘蛋白載體經IPTG 誘導後之蛋白累積情形 71
圖十六、 利用SDS-PAGE及西方轉漬反應分析大量誘導純化回收之細菌載體表現茉莉花C病毒(JaVC)鞘蛋白之結果 72
圖十七、 利用細菌表達鞘蛋白所製備之茉莉花C病毒(JaVC)抗體於瓊脂雙向擴散反應下與田間不同病徵型茉莉花抗原反應之結果 73
圖十八、 利用不同稀釋倍數之茉莉花C病毒(Jasmin virus C, JaVC)鞘蛋白抗體免疫球蛋白於Indirect ELISA下檢測黃化嵌紋病茉莉花樣品之結果 74
圖十九、 利用細菌表達茉莉花C病毒鞘蛋白抗體於Indirect ELISA下檢測不同地區不同病徵型茉莉花樣品之結果 75
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