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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:蔣博豪
研究生(外文):Jiang, Bohao
論文名稱:萃取純化稜軸土人參多醣及促進一氧化氮產生之抑癌效果
論文名稱(外文):The Induction of NO and Anti-tumor Effects of Extracted and Purified Polysaccharides from Talinum triangulare
指導教授:蔡明勳蔡明勳引用關係
指導教授(外文):Tsai, Mingshium
口試委員:王淑紅王維麒
口試委員(外文):Wang, SuehongWang, Weichi
口試日期:2012-07-19
學位類別:碩士
校院名稱:大葉大學
系所名稱:生物產業科技學系
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:100
語文別:中文
論文頁數:85
中文關鍵詞:稜軸土人參多醣的最佳萃取條件一氧化氮促發炎反應抑癌作用
外文關鍵詞:Talinum triangularethe optimal extraction condition of polysaccharidesnitric oxidepromotion of inflammationanti-tumor effect
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衛生署的統計資料顯示,國人因癌症的死亡率已連續三十年為所有致死因素的首位。目前癌症的治療藥物仍以較無專一性的化學藥物為主,常會引起許多副作用,所以較低毒性、甚至無毒的中草藥或天然植物成為抗癌的熱門研究方向。稜軸土人參傳說有許多保健功效,但僅有其多醣的抗氧化能力與保肝功能的文獻發表,因此本研究探討稜軸土人參多醣是否具有調節發炎或抗腫瘤的作用。首先利用L9直交表找出稜軸土人參多醣以純水萃取的最佳條件:以熱回流方式為溫度95℃、固液比1/20、時間150分鐘;以超音波輔助方式為溫度85℃、固液比1/20、時間75分鐘,兩種方式的多醣最大產率同為3.1%。將以乙醇沉澱後的多醣回溶與定量後,利用透析膜將回溶的多醣分離成大、小分子量兩種,這兩種多醣都可活化RAW264.7小鼠巨噬細胞產生發炎作用,使其分泌一氧化氮(NO),但在相同濃度下,大分子量多醣誘導巨噬細胞產生NO的量較多,具有較好的促發炎效果。接著收集經多醣處理後的巨噬細胞培養液,作為腫瘤細胞的條件培養基,結果顯示多醣處理後的條件培養基對子宮頸癌HeLa與大腸癌SW620細胞都具有顯著的抑制生長效果,且大分子量多醣之抑制率較佳,但是直接以多醣處理腫瘤細胞則沒有抑制生長效果。再將大分子量多醣利用陰離子交換樹酯分離出7種分餾液,發現分餾後的多醣誘導NO的產量與對腫瘤細胞的抑制效果均較原大分子量多醣差,可能因調節巨噬細胞免疫反應非單一分餾多醣可完全誘導。由上述結果推測稜軸土人參多醣可以調節巨噬細胞的發炎功能,進而增加抗腫瘤的活性。
According to the statistic results showed by Department of Health, cancer has been the first cause of death in the past three decades. At present, most anti-cancer drugs are less specific, and they may cause many side-effects. Therefore, extracts or compounds from herbals or natural plants have been good choice for evaluation of anti-cancer therapy. Some health-improving activities of Talinum triangulare are widely known and spread, but only anti-oxidative activity and hepatoprotective effect of extracted polysaccharides from Talinum triangulare have been reported. In this study, we examined whether the water-extracted polysaccharides (TTP) from Talinum triangulare can promotion of inflammation and have anti-tumor activities. We also try to explore their active polysaccharide ingredients and mechanisms of inflammation. We first used orthogonal array L9 to find the optimal extraction conditions of TTP by heat reflux and ultrasonic extractions, respectively. The optimal heat reflux extraction conditions are 95℃ incubation temperature, 1:20 ratio of material and water, and 150 minutes of incubation time. The optimal ultrasonic extraction conditions are 85℃ incubation temperature, 1:20 ratio of material and water, and 75 minutes of incubation time. Both methods obtain the maximum 3.1% conversion yield. After ethanol precipitation, TTP were re-dissolved in distilled water. TTP was separated into two molecular weight ranges by dialysis. Various amounts of two kinds of TTP were added into media of RAW264.7 macrophages for analyzing their inflammation activities by measuring nitric oxide (NO) productions. We found that TTP with molecular weights larger than 14kDa could induce more NO synthesis than TTP with molecular weights lower than 14kDa. This result suggests that the larger TTP have higher inflammation activity than the smaller one. Because the NO production is one of inflammatory responses that can suppress tumor cell growth, we analyzed the anti-tumor activity of TTP treated RAW264.7 cells. We collected the media of RAW264.7 cells pre-treated with two types of TTP, virespectively. We treated human cervical cancer HeLa and colorectal cancer SW620 cells with these media. We found the media of TTP pre-treated RAW264.7 cells could significant inhibit HeLa and SW620 cells, and the larger TTP has higher inhibition activity than the smaller TTP. However, both types of TTP have no direct anti-tumor activity. Furthermore, we separated and purified seven kinds of polysaccharides from the large TTP by anion-exchange chromatography, and then we analyzed their inflammation and anti-tumor activities, respectively. Results showed that each separated polysaccharides from TTP has less NO induction and lower anti-tumor activities than the original large TTP. These results may account for that the inflammation and anti-tumor activities are not induced by single type of polysaccharide. From our results, we conclude that TTP has anti-tumor activities through regulating the functions of macrophages.
目錄

封面內頁
簽名頁
中文摘要iii
英文摘要v
誌謝vii
目錄viii
圖目錄xii
表目錄xiv
1.緒論1
2.文獻回顧2
2.1稜軸土人參2
2.2常見中草藥萃取方法簡介4
2.2.1冷浸攪拌萃取法4
2.2.2熱迴流萃取法5
2.2.3超音波輔助萃取5
2.3多醣化合物6
2.4巨噬細胞之功能7
2.5免疫活性評估7
2.6癌症8
2.6.1大腸癌8
2.6.2子宮頸癌9
3.材料與方法10
3.1試驗材料10
3.1.1植物來源10
3.1.2細胞株來源10
3.1.3藥品清單10
3.1.4儀器清單11
3.2稜軸土人參多醣最佳萃取條件12
3.2.1熱迴流萃取稜軸土人參多醣最佳條件12
3.2.2超音波最佳稜軸土人參多醣萃取條件15
3.2.3成分分析-多醣分析16
3.3乙醇沉澱條件評估17
3.4透析膜透析分離大、小分子量多醣17
3.5陰離子交換樹酯分離純化稜軸土人參多醣18
3.5.1 DEAE Sepharose Fast Flow樹酯前處理18
3.5.2以樹酯層析法分離稜軸土人參多醣18
3.6細胞培養20
3.7一氧化氮(NO)產量分析21
3.8稜軸土人參多醣處理所得RAW264.7細胞條件培養液的製備22
3.9免疫調節試驗(抗癌細胞試驗)22
3.9.1利用倒立式顯微鏡檢測多醣溶液處理的癌細胞數目與形態22
3.9.2細胞存活率試驗(Tetrazolium dye colorimetric assay, MTT assay)23
3.10統計分析24
4.結果與討論25
4.1熱迴流萃取單因子探討25
4.1.1熱回流萃取稜軸土人參多醣-不同的萃取溫度對多醣產率之探討25
4.1.2熱回流萃取稜軸土人參多醣-不同的萃取時間對多醣產率之探討27
4.1.3熱回流萃取稜軸土人參多醣-不同的固液比對多醣萃取產率之探討29
4.2熱回流萃取稜軸土人參多醣直交表試驗31
4.3超音波萃取稜軸土人參多醣單因子探討35
4.3.1超音波萃取稜軸土人參多醣-不同的萃取溫度對多醣產率之探討35
4.3.2超音波萃取稜軸土人參多醣-不同的萃取固液比對多醣產率之探討37
4.3.3超音波萃取稜軸土人參多醣-不同的萃取時間對多醣產率之探討39
4.4超音波萃取稜軸土人參多醣直交表試驗41
4.5熱回流萃取與超音波萃取稜軸土人參多醣產率之比較45
4.6乙醇沉澱條件評估47
4.7免疫活性評估-測量一氧化氮(NO)產生量49
4.8利用倒立式顯微鏡檢測經多醣溶液處理的癌細胞數目與形態51
4.8.1稜軸土人參多醣對子宮頸癌細胞株(HeLa)癌細胞數目與形態之影響51
4.8.2稜軸土人參多醣對大腸癌細胞株(SW620)的細胞數目與形態之影響55
4.9以樹酯層析法分離不同稜軸土人參多醣59
4.10各多醣分餾液對巨噬細胞產生NO產量及活化細胞免疫活性評估61
4.11稜軸土人參多醣處理的條件培養液培養癌細胞之生長抑制率評估63
5.結論67
參考文獻69


圖目錄

圖2-1稜軸土人參植株3
圖4-1熱回流萃取稜軸土人參多醣-不同萃取溫度對多醣產率影響26
圖4-2熱回流萃取稜軸土人參多醣-不同萃取時間對多醣產率影響28
圖4-3熱回流萃取稜軸土人參多醣-不同萃取固液比對多醣產率影響30
圖4-4熱回流萃取稜軸土人參多醣-L9直交表試驗中各項萃取因子之訊號與雜訊(S/N)比值34
圖4-5超音波萃取稜軸土人參多醣-不同萃取溫度對多醣產率影響36
圖4-6超音波萃取稜軸土人參多醣-不同萃取固液比對多醣產率的影響38
圖4-7超音波萃取稜軸土人參多醣-不同萃取時間對多醣產率影響40
圖4-8超音波萃取稜軸土人參多醣-L9各項萃取因子之訊號與雜訊(S/N)比值
圖4-9熱回流與超音波萃取稜軸土人參多醣最佳條件之產率比較
圖4-10乙醇沉澱稜軸土人參多醣條件評估-各多醣濃度下乙醇沉澱後多醣回收率之結果48
圖4-11各樣品誘導RAW264.7巨噬細胞產生NO量之比較50
圖4-12利用顯微鏡觀察直接添加大、小分子量稜軸土人參多醣對子宮頸癌細胞數目與形態的影響53
圖4-13利用顯微鏡觀察經由稜軸土人參多醣處理的RAW264.7巨噬細胞條件培養液培養子宮頸癌細胞之數目與形態54
圖4-14利用顯微鏡觀察直接添加大、小分子量稜軸土人參多醣對大腸癌細胞數目與形態的影響56
圖4-15利用顯微鏡觀察經由稜軸土人參多醣處理的RAW264.7巨噬細胞條件培養液培養大腸癌細胞之形態57
圖4-16a利用顯微鏡觀察經由PBS處理的巨噬細胞條件培養液培養大腸癌細胞形態之局部放大圖58
圖4-16b利用顯微鏡觀察經由大分子量多醣處理的巨噬細胞條件培養液培養大腸癌細胞形態之局部放大圖58
圖4-17經由DEAE Sepharose Fast Flow樹酯分離稜軸土人參大分子量多醣60
圖4-18各樣品誘導RAW264.7巨噬細胞產生NO量之比較62
圖4-19條件培養液處理子宮頸癌細胞活性檢測-MTT assay65
圖4-20條件培養液處理大腸癌抗細胞活性檢測-MTT assay66

表目錄

表4-1熱回流萃取稜軸土人參多醣L9直交表各因子與參數範圍32
表4-2熱回流萃取稜軸土人參多醣L9直交試驗表所得結果33
表4-3超音波萃取稜軸土人參多醣L9直交表各因子與參數範圍42
表4-4超音波萃取稜軸土人參多醣L9直交試驗表43
參考文獻
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