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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:曾乙祐
研究生(外文):Zeng,Yi-You
論文名稱:利用微孔二氧化鈦奈米線萃取磷酸化胜肽之選擇性及再現性研究
論文名稱(外文):Mesoporous TiO2 Nanowires for Selective and Reproducible Enrichment of Phosphopeptides
指導教授:吳志哲
指導教授(外文):Wu,Chih-Che
口試委員:王亦生傅在峰
口試委員(外文):Wang,Yi-ShengFu,Tsai-Feng
口試日期:2012-07-03
學位類別:碩士
校院名稱:國立暨南國際大學
系所名稱:應用化學系
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:100
語文別:中文
論文頁數:45
中文關鍵詞:二氧化鈦奈米線磷酸化胜肽孔洞大小定量磷酸化蛋白質體
外文關鍵詞:TiO2 nanowiresphosphopeptidepore size distributionquantitativephosphoproteome
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摘要
在磷酸化蛋白質體學的研究中,人們廣泛的使用二氧化鈦粒子為親和性固相萃取材料,用於純化及分離磷酸化的蛋白質片段,以提高質譜儀器分析的靈敏度。儘管目前已經有許多有關二氧化鈦材料的合成方法文獻發表,但是對於二氧化鈦材料的本身的物理特性如、晶體結構、孔洞性質、材料表面積是否影響萃取磷酸化胜肽的選擇性,並沒有被明確的探討,因此我們利用具有孔洞大一致性的二氧化鈦奈米線,進行二氧化鈦材料特性對磷酸化胜肽的選擇性萃取能力的研究。
藉由調配標準品的莫耳數比例 ( ß-casein:BSA ) 及真實樣品 ( HeLa cell ) 作為二氧化鈦奈米線的選擇性實驗,其結果顯示二氧化鈦奈米線擁有良好的選擇性 ( 1:1500莫耳數比及平均92.0 % 的磷酸化胜肽選擇率 )。接下來利用HeLa cell ( 200μg ) 進行三次重覆的實驗,證明二氧化鈦奈米線具有63.3 % 的磷酸化胜肽重覆率及71.1 % 的磷酸化蛋白質重覆率,而三次重覆實驗的磷酸化胜肽訊號強度平均相對標準偏差百分比為 20.9 % 。最後利用α-casein作為內標準品,應用在HeLa cell ( 100μg、50μg、10μg ) 微量化的定量上,其平均線性平方達到0.95以上的表現。
因此,我們認為孔徑大小一致的二氧化鈦奈米線,應用於蛋白質體學的定量及磷酸化胜肽的選擇性將有很大的幫助。
Abstract
Titanium dioxide (TiO2) affinity enrichment has been widely used in phosphoproteomic studies. Although many attempts have been made to fabricate TiO2-based materials for selective enrichment of phosphopeptides, the effects of structural properties, such as crytsallinity, pore diameter, porosity, and specific surface area of TiO2, on selectivity has not been widely explored. Herein, we synthesized TiO2 nanowires with well-defined nanopores and high specific surface area for selective and reproducible enrichment of phosphopeptides from complex peptide mixture. TiO2 nanowires showed improved performance than TiO2 beads for selective and reproducible detection of phosphopeptides from tryptic digests of ß-casein/BSA mixture (1:1500 molar ratio) and HeLa cell lysates (200 μg). We attributed the high selectivity and reproducibility of TiO2 nanowires for phosphopeptide enrichment to the narrow pore diameter distribution and not to the crytsallinity. The average coefficient of variation of phosphopeptide peak intensity values between three replicates was 20.9 %. Venn diagrams showed extensive overlap of identified phosphopeptides (63.3 %) and phosphoproteins (71.1 %) between three replicates. Quantitative phosphopeptide analysis of HeLa cell lysate digest (from 100 μg to 10 μg ) externally spiked α-casein as internal standard reveal good linear relationship with an average correlation coefficient greater than 0.95. Based on these results, we expect that TiO2 nanowires will be of great interest for quantitative phosphoproteome analysis.

目錄
謝誌. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I
論文摘要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .II
Abstract .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III
目錄 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .V
圖目錄. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .VIII
表目錄. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .IX
第一章 緒論. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
1-1 前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
1-2 磷酸化的重要性. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
1-3 質譜應用於蛋白質體分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2
1-4 蛋白質的定量分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
1-5 二氧化鈦親和性材料介紹. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
1-6 研究動機及目的. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
第二章 實驗儀器及藥品. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2-1 實驗儀器. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
2-2 實驗藥品. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
第三章 實驗方法與步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3-1 二氧化鈦奈米線的製備. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
3-2 二氧化鈦奈米線特性測定之前處理步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
3-2-1 測定比表面積孔洞吸附儀 (BET) 之前處理步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . .13
3-2-2 測定穿透式電子顯微鏡 (TEM) 之前處理步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3-3 標準品酵素消化步驟 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
3-4 真實樣品製備流程. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
3-4-1 細胞培養. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15
3-4-2 破細胞步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3-4-3 細胞蛋白質的酵素消化步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3-4-4 細胞蛋白質去鹽處理步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3-5 基質溶液的配製. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
3-6 二氧化鈦奈米線萃取磷酸化標準品之步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
3-7 二氧化鈦奈米線萃取磷酸化真實樣品之步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
3-8 二氧化鈦 (beads) 萃取磷酸化真實樣品之步驟. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
3-9 資料庫的應用 (Maxquant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
3-9-1資料庫參數設定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
3-9-2檔案內容說明. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
3-9-3磷酸化胜肽及磷酸化位置的數量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
3-9-4定量分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
第四章 實驗結果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4-1穿透式電子顯微鏡 (TEM)測定二氧化鈦奈米線. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
4-2二氧化鈦材料的晶相探討 (XRD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4-3二氧化鈦材料表面吸附及孔洞之探討 (BET) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
4-4二氧化鈦奈米線及其他材料萃取磷酸化標準品. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4-4-1選擇性實驗. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
4-4-2 偵測極限. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4-4-3 吸附量實驗. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4-5使用不同酸類對於二氧化鈦奈米線萃取真實樣品之影響. . . . . . . . . . . . . . . 30
4-6二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads) 萃取真實樣品的比較. . . . . . . . . . . . . 31
4-6-1二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads)的選擇性比較. . . . . . . . . . . . . . . .31
4-6-2二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads)對於獨特磷酸化胜肽
及蛋白質再現性比較. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4-6-3二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads)對於獨特磷酸化胜肽的
訊號強度再現性比較. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
4-7在真實樣品中添加標準品(α-casein)之定量分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
4-8 微量化的真實樣品萃取定量分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
第五章 結果討論. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5-1磷酸化萃取材料的特性 (孔洞、選擇性、再現性) 討論. . . . . . . . . . . . . . . .40
5-2二氧化鈦奈米線萃取真實樣品 (HeLa cell) 之磷酸化胜肽定量討論. . . . . .41
第六章 結論.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
第七章 期刊發表. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Efficient enrichment of phosphopeptides by magnetic TiO2-coated
carbon-encapsulated iron nanoparticles
第八章 參考文獻. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
圖目錄
圖1-2 磷酸化後轉譯修飾示意圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
圖1-3-1 MALDI MS 工作原理示意圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
圖1-4-1 同位素標籤定量流程圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
圖1-5-1 二氧化鈦粒子萃取磷酸化胜肽示意圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
圖1-5-2 二氧化鈦修飾於 MALDI MS sample plate 示意圖及濃縮結果圖. . . . . 8
圖1-5-3 實驗萃取流程圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
圖1-5-4 二氧化鈦修飾在碳包覆鐵的載體之製備流程圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
圖4-1 TEM images of the TiO2 nanowires at different magnifications. . . . . . . . . . .23
圖4-2 XRD測定二氧化鈦材料結果分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
圖4-3 BET測定二氧化鈦材料結果分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
圖4-4-1 MALDI-TOF MS測定二氧化鈦萃取磷酸化胜肽選擇性分析圖. . . . . . 26
圖4-4-2 二氧化鈦奈米線偵測極限分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
圖4-4-3 二氧化鈦奈米線吸附ß-casein,藉由質譜peak的面積換算圖. . . . . . .29
圖4-5 利用TFA 和 Glutamic acid 作為binding buffer,測試二氧化鈦奈米
線對HeLa cell (200μg)的萃取磷酸化胜肽專一性影響. . . . . . . . . . . . . . 30
圖4-6-1二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads)的選擇性比較分析圖. . . . . . . . . . 31
圖4-6-2二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads)對於獨特磷酸化胜肽及蛋白質
再現性比較分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
圖4-6-3二氧化鈦奈米線及二氧化鈦 (beads)對於獨特磷酸化胜肽的訊號強度
再現性比較分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
圖4-7在真實樣品中添加標準品(α-casein)之定量分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
圖4-8微量化的真實樣品萃取定量分析圖. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38
表目錄
表1-4-1 非標記定量α-casein 結果分析表. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
表4-4-1 利用trypsin消化過後的β-casein,經由MALDI-TOF MS鑑定的磷酸
化胜肽之分析表. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
表4-7-1在真實樣品中添加標準品(α-casein)之胜肽定量分析表 . . . . . . . . . . . . 35
表4-7-2在真實樣品中添加標準品(α-casein)之蛋白質定量分析表. . . . . . . . . . . 36
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