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研究生:陳昭南
論文名稱:Agrobacterium sp. ATCC 31750菌株所產阿洛酮糖表異構酶之基因選殖、表現、純化及特性探討
論文名稱(外文):Cloning, Expression, Purification, Characterization of D-psicose 3-epimerase from Agrobacterium sp. ATCC 31750
指導教授:方翠筠
指導教授(外文):Tsuei-Yun Fang
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:食品科學系
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:100
語文別:中文
論文頁數:114
中文關鍵詞:阿洛酮糖表異構酶阿洛酮糖果糖
外文關鍵詞:Agrobacterium sp. ATCC 31750D-psicose 3-epimerase
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D-阿洛酮糖 (D-psicose, D-ribo-2-hexulose or D-allulose) 為一種具有特殊生理活性且昂貴的稀有醣類。目前已知用來生產 D-阿洛酮糖的酵素皆為 DTE 家族酶 (EC 5.1.3),其催化機制為將六碳酮醣 3 號碳上並進行酮醣-酮醣間轉換。D-阿洛酮糖表異構酶 (D-psicose 3-epimerase, DPE) 屬於 DTE-家族酶的其中一員,即為一種能催化 D-果糖 (D-fructose) 與 D-阿洛酮糖 (D-psicose) 之間轉換的酵素,此外,亦能將 D-塔格糖 (D-tagatose) 轉換成 D-山梨糖 (D-sorbose)。
本實驗選用中溫菌 Agrobacterium sp. ATCC 31750 作為來源,將其基因 dpe 藉由選殖的方式建構於載體中形成重組型載體 (pET-21b-dpe-6H),並將終止密碼子刪除,使其可表現出 C 端帶有六個組胺酸 (His-tag) 的蛋白以利後續純化,將此重組型載體 pET-21b-dpe-6H 轉形至宿主 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 表現,經由 20 小時培養並添加 0.05 mM IPTG 下進行誘導,有助於大量表現具有活性之目標蛋白。重組型 DPE 的單體分子量約為 32 kDa,且經過鎳離子親和性管柱進行純化,並以緩衝液透析可得到純化之酵素,其比活性為 116 U/mg,活性回收率為 194%,純化倍率則為 20.9。重組型 DPE 之最適作用溫度為 60-65℃,最適作用 pH 值為 pH 7-9 之間,在不添加金屬離子、Ca2+、Cu2+、Zn2+ 和 EDTA時,DPE 不具有酵素活性,添加 Ni2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Fe2+ 皆可提升其酵素活性,重組型 DPE 在 30℃ 以下保溫 2 小時以及在 pH 7-9 的緩衝液中保存 24 小時並無明顯的活性喪失,表示在此環境下酵素具有良好的穩定性,半衰期為 55℃,10 分鐘,最適作用基質為 D-阿洛酮糖,且在 55℃ 下反應 40 分鐘即可到達最大轉換率 30%。

D-Psicose also known as D-ribo-2-hexulose or D-allulose is one of rare sugars that exhibit unique bioactivity but only exists in trace amount in nature. The of DTEase family enzymes (EC 5.1.3) catalyze the C3 conversion between different ketohexoses, and are currently used to produce D-Psicose from D-Fructose. D-Psicose 3-epimerase (DPE), a DTEase family enzyme that catalyzes the epimerization of D-fructose and D-psicose to form two epimers, but also reacted on D-tagatose and D-sorbose.
In this study, the mesophilic bacteria Agrobacterium sp. ATCC 31750 was used as the source strain. The gene dpe was successfully cloned into vector pET-21b, and the stop codon of the dpe gene was deleted, then expressed recombinant DPE containing the His-tag at the C-terminal for further purification. The recombinant pET-21b-dpe-6H was transformed into E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL, and the target protein was overexpressed after 20 hour incubation in the presence of 0.05 mM IPTG. The molecular weight of the recombinant DPE is about 32 kDa. After purified by nickel-chelating chromatography and dialysed overnight, recombinant DPE had a specific activity of 116 U/mg and purified 20.9 fold with a yield of 194%.
The optimum temperature and pH of recombinant DPE were 60-65℃ and pH 7.0-9.0. In the absence of any metal ion and the presence of 1 mM Ca2+, Cu2+, Zn2+, EDTA, the enzyme is inactive. The presence of 1 mM Ni2+, Mg2+, Mn2+, Co2+ and Fe2+ would enhanced the enzyme activity. In addition, recombinant DPE were quite stable at 30℃ and in the pH range of 7-9.The equilibrium ratio between D-Psicose and D-fructose was 30:70 at 55℃.

目錄
摘要 I
Abstract III
目錄 V
表目錄 XI
圖目錄 XII
附錄目錄 XIV
壹、前言 1
貳、文獻整理 4
一、稀有醣類背景 4
二、稀有醣類介紹 5
1. D-阿洛酮糖 (D-Psicose) 簡介 5
2. D-塔格糖 (D-Tagatose) 簡介 7
三、生產 D-阿洛酮糖相關酵素 9
1. DTE-家族酶 9
2. 不同菌株來源之 DTE-家族酶探討 10
2.1 Pseudomonas cichorii 來源之 D-塔格糖表異構酶 (PcDTE) 10
2.2 Agrobacterium tumefaciens 來源之 D-阿洛酮糖表異構酶 (AtDPE) 11
2.3 Rhodobacter sphaeroides 來源之 D-塔格糖表異構酶 (RsDTE) 12
2.4 Clostridium cellulolyticum H10 來源之 D-阿洛酮糖表異構酶 (CcDPE) 13
四、Agrobacterium sp. ATCC 31750 介紹 14
叄、實驗流程設計 16
肆、實驗材料方法 17
一、實驗材料 17
1. 菌株與載體 17
1.1 dpe 基因來源 17
1.2 質體來源 17
1.3 菌株來源 17
2. 抗生素 17
3. 標準品 18
3.1 DNA 標準品 18
3.2 蛋白質標準品 18
4. 市售套組 18
5. 酵素 18
6. 化學藥品 19
7. 實驗設備 23
二、實驗方法 26
1. 基因選殖 Agrobactrium sp. ATCC 31750 來源之 dpe 26
1.1 基因體 DNA 26
1.2 製備小量質體 DNA 27
1.3 製備 DNA 洋菜膠體 29
1.4 DNA 定量與品質 29
1.5 設計 dpe 引子對 29
1.6 PCR 擴增反應 30
1.6.1 第一階段 PCR 反應 30
1.7 以限制酶處理建構 dpe 至載體 31
1.7.1 剪切反應 31
1.7.2 膠純化回收 DNA 32
1.7.3 接合反應 33
2. 轉形作用及重組質體之篩選 34
2.1 製備 E. coli DH5α 電穿孔勝任細胞 34
2.2 製備 E. coli DH5α 熱休克勝任細胞 34
2.3 電穿孔轉形作用 35
2.4 熱休克轉形作用 36
2.5 Colony PCR 篩選轉形株 36
2.6 膠電泳分析 37
2.7 序列分析 38
2.8 菌種保存 38
3. 重組型 DPE 之蛋白質表現與純化 39
3.1 製備 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 電穿孔勝任細胞 39
3.2 重組型 DPE 轉形至大腸桿菌中之表現 40
3.3 重組型 DPE 之純化 40
3.4 蛋白質定量 41
3.4.1 製備定量蛋白質之相關試劑 42
3.4.2 測定蛋白質濃度 42
3.5 蛋白質電泳分析 43
3.5.1 膠體製備 43
3.5.2 試劑配法 44
3.6 膠電泳之操作方法 45
3.6.1 2X SDS sampling buffer 製備 46
3.6.2 膠片的染色與脫色 46
3.6.3 染色液的製備 46
3.6.4 脫色液的製備 47
4. 重組型 DPE 之活性分析與特性探討 47
4.1 酵素活性分析 47
4.1.1 酵素反應 47
4.1.2 D-阿洛酮糖定量 48
4.1.3 活性定義 48
4.1.4 HPLC-ELSD 分析 48
4.1.5 HPLC 分子篩管柱層析鑑定原態分子量 49
4.1.5 HPLC 質譜儀鑑定分子量 50
4.2 酵素特性探討 50
4.2.1 最適作用溫度 50
4.2.2 最適作用 pH 值 50
4.2.3 熱穩定性及半衰期 51
4.2.4 pH 穩定性 51
4.2.5 金屬離子影響 52
4.2.6 基質特異性 52
4.2.7 轉換率 53
伍、結果與討論 54
一、基因選殖 Agrobacterium sp. ATCC 31750 來源之 dpe 54
二、重組型 DPE 至大腸桿菌之表現與純化 56
三、重組型 DPE 酵素反應後之產物組成 58
四、重組型 DPE 之特性探討 59
1. 金屬離子之影響 59
2. 最適作用溫度 60
3. 最適作用 pH 值 61
4. 熱穩定性及半衰期 62
5. pH 穩定性 63
6. 基質特異性 64
7. 轉換率 65
陸、結論 66
柒、參考文獻 68


表目錄
表一、Agrobacterium sp. ATCC 31750 D-阿洛酮糖表異構酶之基因選殖引子序列分析 75
表二、表現於大腸桿菌 BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 之重組型 D-阿洛酮糖表異構酶純化表 76
表三、金屬離子對重組型 DPE 活性之影響 77
表四、不同基質對重組型 DPE 之異構化作用 78


圖目錄
圖一、 Agrobacterium tumefaciens dpe 胺基酸序列與 Agrobacterium sp. ATCC 31749 胺基酸序列同源性比較 79
圖二、 洋菜膠體電泳分析 Agrobacterium sp. ATCC 31750 之模板基因組 DNA 80
圖三、 洋菜膠體電泳分析第一階段 PCR 擴增之產物 81
圖四、 洋菜膠體電泳分析經限制酶剪切處理過之載體 pET-21b 以及第一階段 PCR 擴增之 dpe 產物 82
圖五、 洋菜膠體電泳分析以 T7 引子對擴增 colony PCR 後之產物 83
圖六、 SDS-PAGE 膠電泳分析含有 pET-21b-dpe-6H 之 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 在不同濃度 IPTG 誘導下之菌體內總蛋白質分布情形 84
圖七、 以 Biosep SEC S-2000 管柱搭配 HPLC 分析 Agrobacterium sp. ATCC 31750 DEP 之分子量 85
圖八、 以 MALDI-TOF 質譜儀分析 Agrobacterium sp. ATCC 31750 DPE 之分子量 86
圖九、 SDS-PAGE 膠電泳分析含有重組型 DPE 之 E. coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL 於各純化過程之蛋白質分佈與表現 87
圖十、 以高效能液相層析管柱分析 D-果糖經酵素反應後之產物組成 88
圖十一、 溫度對重組型 D-阿洛酮糖表異構酶活性之影響 89
圖十二、 pH 值對重組型 D-阿洛酮糖表異構酶活性之影響 90
圖十三、 重組型 D-阿洛酮糖表異構酶對溫度之穩定性 91
圖十四、 重組型 D-阿洛酮糖表異構酶於 55℃ 下之穩定性 92
圖十五、 重組型 D-阿洛酮表異構酶對 pH 之穩定性 93
圖十六、 重組型 D-阿洛酮表異構酶之果糖轉換率 94


附錄目錄
附錄一、所有六碳醣之生產轉換策略圖 95
附錄二、P. cichorii D-塔格糖表異構酶 (PcDTE) 催化 D-塔格糖與 D-果糖之異構化反應 96
附錄三、藉由 D-塔格醣表異構酶以及多元脫氫酶來連接轉換所有六碳酮醣 97


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