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研究生:陳雅嵐
論文名稱:源自Thermoanaerobacterium saccharolyticum NTOU1 之 L-鼠李糖異構酶的固定化探討
論文名稱(外文):Immobilization of L-Rhamnose Isomerase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum NTOU1
指導教授:方翠筠
指導教授(外文):Tsuei-Yun Fang
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:食品科學系
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:100
語文別:中文
論文頁數:70
中文關鍵詞:固定化鼠李糖異構酶NTOU1阿洛糖
外文關鍵詞:immobilization of L-rhamnose isomeraseNTOU1Allose
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本研究分為兩大部分,為探討利用離子交換樹脂固定L-鼠李糖異構酶 (L-rhamnose isomerase, L-RhI) 之最適條件與固定化 L-RhI 特性分析。採用 L-RhI是源自Thermoanaerobacterium saccharolyticum NTOU1基因,而使用的離子交換樹脂為Amberlite® XAD7HP (XAD7) 與 Amberlite® XAD4 (XAD4)。本研究探討的固定化條件包括固定化時間、pH 值及戊二醛濃度 (Glutaraldehyde),根據探討固定化時間與pH 值的結果顯示,酵素吸附率與相對活性皆以XAD7 載體顯著高於 XAD4 載體,且 XAD7 載體於 pH 8.5 及固定兩小時具有較高效率;戊二醛濃度探討中,則以 XAD4 載體具有較高的酵素吸附率與固定化活性,但與未經戊二醛處理之 XAD7 在 pH 8.5 下進行固定化比較,其固定活性卻大幅下降,故本研究後續實驗皆採用 XAD7於pH 8.5 下固定兩小時之固定條件。固定化 L-RhI 於電子顯微鏡分析確認酵素固定於 XAD7載體上,此最適作用溫度與 pH 值分別為 80℃ 與 pH 7.5,最適作用溫度與 pH 值皆高於游離態 L-RhI 酵素。而固定化 L-RhI經過重覆使用十六次後仍保持 80 % 的活性。


The research work can be concluded into two parts: optimization of conditions for immobilization of L-rhamnose isomerase (L-RhI) on Amberlite and characterization of immobilized L-RhI. The recombinant L-RhI from Thermoanaerobacterium saccharolyticum NTOU1 was immobilized on two types of Amberlites, Amberlite® XAD7HP (XAD7) and Amberlite® XAD4 (XAD4), respectively. The studies on the optimal conditions of immobilization included time, pH and glutaraldehyde concentration. From the studies for immobilization time and pH, the results showed that XAD7 carrier was better than XAD4 carrier on the absorption of enzyme and relative activity of immobilized enzyme. But the result from the immobilization with glutaraldehyde concentration showed that XAD4 carriers were better than XAD7 carriers on the absorption of enzyme and relative activity of the immobilized enzyme. Under all the tested immobilization conditions, the activity on XAD7 carrier immobilized in pH 8.5 for 2 h was higher than that on XAD4 carrier immobilized in pH 7 and 4% glutaraldehyde for 2 h, and XAD7 carrier immobilized in pH 8.5 for 2 h has the highest immobilization efficiency. The optimal pH and temperature for immobilized L-RhI were 7.5 and 80℃, respectively. The optimal pH and temperature were higher than those of free enzyme. Afer being used sixteen times, the activity of the immobilized L-RhI was 80 % retained.
壹、 研究背景與目的 1
一、研究背景 1
二、研究目的 2
貳、文獻整理 3
一、L-鼠李糖異構酶 3
1. 鼠李糖異構酶背景 3
2. 源自E. coli K12基因之 L-RhI 4
3. 源自P. stutzeri基因之 L-RhI 5
4. 源自B. pallidus Y25基因之 L-RhI 5
5. 源自B. halodurans基因之 L-RhI 6
6. 源自T. maritima基因之 L-RhI 6
7.源自C. saccharolyticus基因之 L-RhI 7
8. 源自T. saccharolyticum NTOU1基因之 L-RhI 8
8-1. T. saccharolyticum NTOU1 介紹 8
二、稀有糖類 (rare sugars) 10
1.簡介 10
2. D-阿洛糖 (D-allose) 10
壹、 研究背景與目的 1
一、研究背景 1
二、研究目的 2
貳、文獻整理 3
一、L-鼠李糖異構酶 3
1. 鼠李糖異構酶背景 3
2. 源自E. coli K12基因之 L-RhI 4
3. 源自P. stutzeri基因之 L-RhI 5
4. 源自B. pallidus Y25基因之 L-RhI 5
5. 源自B. halodurans基因之 L-RhI 6
6. 源自T. maritima基因之 L-RhI 6
7.源自C. saccharolyticus基因之 L-RhI 7
8. 源自T. saccharolyticum NTOU1基因之 L-RhI 8
8-1. T. saccharolyticum NTOU1 介紹 8
二、稀有糖類 (rare sugars) 10
1.簡介 10
2. D-阿洛糖 (D-allose) 10
三、固定化酵素 11
1.簡介 11
2.固定化酵素之方法 13
2-1物理吸附法 (physical adsorption) 13
2-2共價鍵結法 (covalent binding) 14
2-3.包覆法 (entrapment) 15
3. 吸附載體介紹 15
參、實驗設計與流程 17
一、 T. saccharolyticum NTOU1 之 L-RhI 之固定化條件探討 17
1.實驗設計 17
2.實驗流程 17
二、T. saccharolyticum NTOU1 之 固定化 L-RhI 之特性探討 18
1.實驗設計 18
2.實驗流程 18
肆、實驗材料與方法 19
一、實驗材料 19
1.實驗菌株 19
2.實驗藥品清單 19
3. 儀器設備 22
二、實驗方法 24
1. 源自 T. saccharolyticum NTOU1 之 L-RhI 之固定化條件探討 24
2. 源自 T. saccharolyticum NTOU1 之 L-RhI 經固定化後之酵素特性分析 31
伍、結果與討論 34
一、固定化條件探討 34
1. 固定化時間條件探討 35
2. 固定化 pH 值條件探討 36
3. 固定化交聯劑濃度探討 37
二、固定化酵素特性分析 39
1. 電子顯微鏡分析 39
2. 最適作用溫度分析 39
3. 最適作用 pH 值 40
4. pH 穩定性 40
5.重覆使用率 41
陸、結論 42
柒、參考文獻 43


壹、 研究背景與目的 1
一、研究背景 1
二、研究目的 2
貳、文獻整理 3
一、L-鼠李糖異構酶 3
1. 鼠李糖異構酶背景 3
2. 源自E. coli K12基因之 L-RhI 4
3. 源自P. stutzeri基因之 L-RhI 5
4. 源自B. pallidus Y25基因之 L-RhI 5
5. 源自B. halodurans基因之 L-RhI 6
6. 源自T. maritima基因之 L-RhI 6
7.源自C. saccharolyticus基因之 L-RhI 7
8. 源自T. saccharolyticum NTOU1基因之 L-RhI 8
8-1. T. saccharolyticum NTOU1 介紹 8
二、稀有糖類 (rare sugars) 10
1.簡介 10
2. D-阿洛糖 (D-allose) 10
三、固定化酵素 11
1.簡介 11
2.固定化酵素之方法 13
2-1物理吸附法 (physical adsorption) 13
2-2共價鍵結法 (covalent binding) 14
2-3.包覆法 (entrapment) 15
3. 吸附載體介紹 15
參、實驗設計與流程 17
一、 T. saccharolyticum NTOU1 之 L-RhI 之固定化條件探討 17
1.實驗設計 17
2.實驗流程 17
二、T. saccharolyticum NTOU1 之 固定化 L-RhI 之特性探討 18
1.實驗設計 18
2.實驗流程 18
肆、實驗材料與方法 19
一、實驗材料 19
1.實驗菌株 19
2.實驗藥品清單 19
3. 儀器設備 22
二、實驗方法 24
1. 源自 T. saccharolyticum NTOU1 之 L-RhI 之固定化條件探討 24
2. 源自 T. saccharolyticum NTOU1 之 L-RhI 經固定化後之酵素特性分析 31
伍、結果與討論 34
一、固定化條件探討 34
1. 固定化時間條件探討 35
2. 固定化 pH 值條件探討 36
3. 固定化交聯劑濃度探討 37
二、固定化酵素特性分析 39
1. 電子顯微鏡分析 39
2. 最適作用溫度分析 39
3. 最適作用 pH 值 40
4. pH 穩定性 40
5.重覆使用率 41
陸、結論 42
柒、參考文獻 43

圖目錄
圖一、 藉由 L-RhI 生產D-阿洛糖之示意。................................. 50
圖二、 源自大腸桿菌 L-RhI 之四聚體結構。............................... 51
圖三、 L-RhI 單體結構。…………………………………………. 52
圖四、 L -RhI 反應機。..........…………………………………… 53
圖五、 源自大腸桿菌之 L-RhI 之基質結合機制。....................... 54
圖六、 假單胞菌 L-RhI 四級結構。……………………………… 55
圖七、 構成Amberlite XAD4之結構。…………………………. 56
圖八、 構成Amberlite XAD7之結構。…………………………… 57
圖九、 固定化時間對不同載體之固定化 L-RhI 吸附率影響。 58
圖十、 固定化時間對不同載體之固定化 L-RhI 活性之影響。 59
圖十一、 固定化 pH 值之條件對不同載體之固定化 L-RhI 吸附率之影。.......................................................................................
60
圖十二、 固定化 pH 對不同載體之固定化 L-RhI 活性影響。 61
圖十三、 固定化戊二醛濃度對不同載體之固定化 L-RhI 顏色影。………………………………………………………………….
62
圖十四、 固定化戊二醛濃度對不同載體之固定化 L-RhI 吸附量之影響。.......................................................................................
63
圖十五、 固定化戊二醛濃度對不同載體之固定化 L-RhI 活性影。…………………………………………………………………
64
圖十六、 RhI-XAD7 於電子顯微鏡下肢觀察結果。…………. 65
圖十七、 溫度對固定化 L -RhI 活性之影響。………………….. 66
圖十八、 pH 值對固定化 L-RhI 活性之影響。…………………. 67
圖十九、 pH 值對固定化 L-RhI 穩定性之影響。………………. 68
圖二十、 固定化 L-RhI 重覆使用對活性之影響。..................... 69

表目錄
表一、進行酵素固定化需探討的項目。………………………… 70


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