臺灣博碩士論文加值系統

在本篇論文中，我利用了實驗室許純淵博士所開發出的金奈米粒子薄膜基板生物感測器並使用化學及免疫反應的分子修飾法成功的修飾並且偵測溶液中的丙烯醛和蛋白質共軛的衍生物，並且針對不同濃度的丙 醛蛋白質共軛化合物溶液進行偵測，得到濃度與UV/Vis吸收度變化量的校正曲線，並且發現丙烯醛蛋白質共軛化合物溶液之濃度與UV/Vis吸收度的變化量呈現一個正相關關係。

Acrolein (CH2-CH=CHO) is known as a ubiquitous pollutant in the environment and also as a major product of the lipid peroxidation reaction. In this thesis, we provide a method to modify APTMS﹑acrolein bound BSA and acrolein(conjugated) antibody on Au-LSPR biosensor sequentially by chemical and immune reaction. The specific affinity between antibody and antigen make the achievement of acrolein bound BSA detection qualitatively. By observing the calibration curve of different concentration acrolein-BSA solutions, the positive correlation between acrolein-BSA solution concentration and signal increasing was found. There is still something we have to do to optimize the signal enhancement in our Au-LSPR biosensor to make quantitative detection possible.

目錄
摘要 I
ABSTRACT II
目錄 III
圖目錄 V
表目錄 VII
第一章 文獻回顧 1
一.1 生物感測器 1
一.2 免疫感測器之分類 2
一.3 表面電漿共振 4
一.5 侷域性表面電漿共振應用於生物感測器 10
一.5.1侷域性表面電漿共振應用於溶液中之生物感測器 10
一.5.2 侷域性表面電漿共振應用於基板上之生物感測器 14
一.5.3 侷域性表面電漿共振應用於粒子鑲嵌基板上之生物感測器 16
一.5.4 利用微波電漿加熱法快速製作金奈米粒子鑲嵌基板 19
第二章 研究動機 21
二.1 自由基 21
二.1.1 人體內自由基的來源 22
二.1.2 自由基會引起慢性疾病 22
二.2 人體內的抗氧化機制 23
二.3 丙烯醛(Acrolein) 24
第三章 實驗 30
三.1 實驗儀器 30
三.2藥品與器材 31
三.3 實驗步驟 32
三.3.1 金奈米粒子薄膜基板製作 32
三.3.2 金奈米粒子薄膜基板之表面修飾 33
三.3.2.1 修飾APTMS於金奈米粒子之間 33
三.3.2.2 Acrolein-BSA(conjugate)修飾於APTMS分子上 35
三.3.2.3 Anti-Acrolein(conjugated) antibody修飾於Acrolein-BSA(conjugate)上 37
第四章 結果與討論 39
四.1 修飾APTMS於金奈米玻璃基板上之原因與以及鍵結探討 39
四.1.1 選擇以APTMS修飾於金奈米玻璃基板之原因 39
四.1.2 以拉曼光譜儀鑑定APTMS之修飾與sol-gel反應 41
四.1.3 修飾APTMS於金奈米玻璃基板之UV吸收光譜 43
四.2. 以UV/VIS光譜鑑定Acorlein-BSA(conjugate)之修飾 45
四.2.1 APTMS修飾Acorlein-BSA(conjugate)前後之UV光譜圖比較 45
四.2.2 浸泡BSA溶液於修飾APTMS之金奈米粒子玻璃基板與修飾Acrolein-BSA(conjugate)後的UV/VIS光譜比較 47
四.2.3 比較金奈米粒子基板直接浸泡Acorlein-BSA(conjugate)溶液與正常修飾步驟之Acrolein-BSA(conjugate) UV/VIS吸收光譜 48
四.3 修飾Anti-Acorlein(conjugated) antibody於Acrolein-BSA(conjugate)上並偵測其UV/Vis訊號 51
四.4 Acrolein-BSA(conjugate)定量實驗之校正曲線與其結果 54
四.5 金奈米粒子薄膜基板偵測方法偵測Acrolein-BSA(conjugate)與ELISA偵測Acrolein-BSA(conjugate)之比較 55
第五章 結論 56
第六章 未來展望 57
參考文獻 58












圖目錄
圖1-1、生物感測器作用示意圖。 2
圖1-2、電荷在金屬表面產生集體偶級震盪示意圖。 4
圖1-3、以Kretschmann組態激發表面電漿波。 5
圖1-4、表面電漿共振應用於免疫感測器之工作原理。 6
圖1-5、金屬奈米粒子的侷域性表面電漿共振。 7
圖1-6、不同形狀、不同大小的金屬奈米粒子皆具有特殊的表面電漿共振吸收波長。 7
圖1-7、(a)金奈米粒子的SEM影像與相對應的光學顯微鏡像，顯示出其顏色與奈米粒子大小、形狀及偶合等有關連(b)以平行金奈米柱長軸方向的偏振光照射時，所呈現的散色光之光子能量分布。 8
圖1-8、不同直徑金奈米粒子之UV-Vis吸收光譜。 8
圖1-9、表面吸附不同有機分子的表面電漿吸收波長之變化。 9
圖1-10、LSPR應用於免疫感測器之工作原理(http://lamdagen.com/lspr-faq)。 10
圖1-11、Dextran修飾於金奈米粒子。 11
圖1-12、葡萄糖分子之感測器機制。 12
圖1-13、金膠體溶液感測葡萄糖分子。 13
圖1-14、各種不同濃度葡萄糖溶液之光譜圖。 13
圖1-15、(a)多功能感測晶片製作過程。(b)多功能感測晶片之樣式。 15
圖1-16、(a)LSPR實驗設置(b)抗體、抗原間的結合過程。 16
圖1-17、不同溫度下燒結下金奈米粒子嵌入基板的AFM圖。 17
圖1-18、金奈米基板製作過程。 18
圖1-19、(a)600℃燒結10小時(b)再利用碘酊溶解表面。 18
圖1-20、(a)利用微波電漿加熱法製備金奈米粒子薄膜基板以及使用王水溶解基板表面金示意圖(b)王水腐蝕前後金奈米薄膜基板之狀況。 20
圖2-1、化學鍵均裂形成自由基示意圖。 21
圖2-2、健康的人與病患體內Acrolein衍生物濃度比較示意圖。 25
圖2-3、HNE及其胺基衍生物[31]。 27
圖2-4、ELISA法偵測Acrolein實驗過程示意圖。 27
圖2-5、GA(戊二醛)分子式意圖。 28
圖2-6、 APTMS與Lysine分子比較圖。 29
圖3-1、微波電漿加熱法製作金奈米粒子薄膜基板。 32
圖3-2、APTMS分子式意圖。 33
圖3-3、修飾APTMS分子於金奈米粒子空隙之間 34
圖3-4、修飾Acrolein-BSA(conjugate)於APTMS上 36
圖3-5、修飾Anti-Acrolein(conjugated) antibody於Acrolein-BSA(conjugate)上示意圖。 38
圖4-1.1精胺酸與丙烯醛反應示意圖[36]。 40
圖4-1.2、APMTS分子式意圖。 40
圖4-2、APTMS修飾於金奈米薄膜基板之拉曼吸收光譜。 42
圖4-3、APTMS特徵吸收峰標示。 43
圖4-4、裸金之UV-Vis吸收光譜。 44
圖4-5、APTMS之UV-Vis吸收光譜。 44
圖4-6、APTMS之UV/Vis吸收光譜圖。 46
圖4-7、Acrolein-BSA(conjugate)之UV/Vis吸收光譜圖。 46
圖4-8、浸泡BSA與浸泡Acrolein-BSA(conjugate)於修飾上APTMS之基板UV/Vis吸收光譜比較圖。 48
圖4-9、於裸金上直接浸泡Acorlein-BSA(conjugate)溶液之UV/Vis吸收光譜。 49
圖4-10、正常情況下之金奈米粒子薄膜基板SEM圖。 50
圖4-11、遭改變形貌後的金奈米粒子薄膜基板SEM圖。 51
圖4-12、修飾Anti-Acrolein(conjugated) antibody前之UV-Vis吸收光譜。 53
圖4-13、修飾Anti-Acrolein(conjugated) antibody後之UV/Vis吸收光譜。 53
圖4-14、Acrolein-BSA(conjugate)不同濃度之校正曲線圖。 54










表目錄

表3.1 實驗儀器清單。 30
表3.2 藥品與器材清單。 31
表4.1 Anti-Acrolein(conjugated) antibody對不同抗原的反應性比較表。 52

(1)吳宗正, 生物感測器.
(2)Shankaran, D. R.; Gobi, K. V. A.; Miura, N. Sens. Actuator B-Chem. 2007, 121, 158. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest.
(3)Luppa, P. B.; Sokoll, L. J.; Chan, D. W. Clin. Chim. Acta 2001, 314, 1. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry.
(4)Ricci, F.; Volpe, G.; Micheli, L.; Palleschi, G. Anal. Chim. Acta 2007, 605, 111. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.
(5)吳民耀, 劉. 物理雙月刊 2006, 28. 表面電漿子理論與模擬.
(6)http://monet.physik.unibas.ch/~bouhelie/
(7)Kelly, K. L.; Coronado, E.; Zhao, L. L.; Schatz, G. C. J. Phys. Chem. B 2003, 107, 668. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment.
(8)Anker, J. N.; Hall, W. P.; Lyandres, O.; Shah, N. C.; Zhao, J.; Van Duyne, R. P. Nat. Mater. 2008, 7, 442. Biosensing with plasmonic nanosensors.
(9)Ghosh, S. K.; Pal, T. Chem. Rev. 2007, 107, 4797. Interparticle coupling effect on the surface plasmon resonance of gold nanoparticles: From theory to applications.
(10)曾賢德 物理雙月刊 2010, 32, 126. 金奈米粒子的表面電漿共振特性:耦合、應用樣品製作.
(11)Aslan, K.; Zhang, J.; Lakowicz, J. R.; Geddes, C. D. J. Fluoresc. 2004, 14, 391. Saccharide sensing using gold and silver nanoparticles - A review.
(12)Radhakumary, C.; Sreenivasan, K. Anal. Chem. 2011, 83, 2829. Naked Eye Detection of Glucose in Urine Using Glucose Oxidase Immobilized Gold Nanoparticles.
(13)Endo, T.; Kerman, K.; Nagatani, N.; Hiepa, H. M.; Kim, D. K.; Yonezawa, Y.; Nakano, K.; Tamiya, E. Anal. Chem. 2006, 78, 6465. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip.
(14)Vestergaard, M.; Kerman, K.; Kim, D. K.; Hiep, H. M.; Tamiya, E. Talanta 2008, 74, 1038. Detection of Alzheimer''s tau protein using localised surface plasmon resonance-based immunochip.
(15)Karakouz, T.; Tesler, A. B.; Bendikov, T. A.; Vaskevich, A.; Rubinstein, I. Adv. Mater. 2008, 20, 3893. Highly Stable Localized Plasmon Transducers Obtained by Thermal Embedding of Gold Island Films on Glass.
(16)Karakouz, T.; Maoz, B. M.; Lando, G.; Vaskevich, A.; Rubinstein, I. ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, 978. Stabilization of Gold Nanoparticle Films on Glass by Thermal Embedding.
(17)Hsu, C. Y.; Huang, J. W.; Gwo, S.; Lin, K. J. Nanotechnology 2010, 21. The facile fabrication of tunable plasmonic gold nanostructure arrays using microwave plasma.
(18)周公度, 化學詞典.
(19)Gutteridge, J. M. C. Free Radic. Res. Commun. 1993, 19, 141. FREE-RADICALS IN DISEASE PROCESSES - A COMPILATION OF CAUSE AND CONSEQUENCE.
(20)林天送, 自由基化學與醫學.
(21)Halliwell, B. Lancet 1994, 344, 721. FREE-RADICALS, ANTIOXIDANTS, AND HUMAN-DISEASE - CURIOSITY, CAUSE, OR CONSEQUENCE.
(22)Uchida, K.; Kanematsu, M.; Morimitsu, Y.; Osawa, T.; Noguchi, N.; Niki, E. J. Biol. Chem. 1998, 273, 16058. Acrolein is a product of lipid peroxidation reaction - Formation of free acrolein and its conjugate with lysine residues in oxidized low density lipoproteins.
(23)Uchida, K.; Kanematsu, M.; Sakai, K.; Matsuda, T.; Hattori, N.; Mizuno, Y.; Suzuki, D.; Miyata, T.; Noguchi, N.; Niki, E.; Osawa, T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998, 95, 4882. Protein-bound acrolein: Potential markers for oxidative stress.
(24)Mantovani, G.; Maccio, A.; Madeddu, C.; Mura, L.; Gramignano, G.; Lusso, M. R.; Mulas, C.; Mudu, M. C.; Murgia, V.; Camboni, P.; Massa, E.; Ferreli, L.; Contu, P.; Rinaldi, A.; Sanjust, E.; Atzei, D.; Elsener, B. Int. J. Cancer 2002, 98, 84. Quantitative evaluation of oxidative stress, chronic inflammatory indices and leptin in cancer patients: Correlation with stage and performance status.
(25)Sakata, K.; Kashiwagi, K.; Sharmin, S.; Ueda, S.; Irie, Y.; Murotani, N.; Igarashi, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, 143. Increase in putrescine, amine oxidase, and acrolein in plasma of renal failure patients.
(26)Lovell, M. A.; Xie, C. S.; Markesbery, W. R. Neurobiol. Aging 2001, 22, 187. Acrolein is increased in Alzheimer''s disease brain and is toxic to primary hippocampal cultures.
(27)Tomitori, H.; Usui, T.; Saeki, N.; Ueda, S.; Kase, H.; Nishimura, K.; Kashiwagi, K.; Igarashi, K. Stroke 2005, 36, 2609. Polyamine oxidase and acrolein as novel biochemical markers for diagnosis of cerebral stroke.
(28)Yoshida, M.; Tomitori, H.; Machi, Y.; Katagiri, D.; Ueda, S.; Horiguchi, K.; Kobayashi, E.; Saeki, N.; Nishimura, K.; Ishii, I.; Kashiwagi, K.; Igarashi, K. Atherosclerosis 2009, 203, 557. Acrolein, IL-6 and CRP as markers of silent brain infarction.
(29)Calingasan, N. Y.; Uchida, K.; Gibson, G. E. J. Neurochem. 1999, 72, 751. Protein-bound acrolein: A novel marker of oxidative stress in Alzheimer''s disease.
(30)Pocernich, C. B.; Cardin, A. L.; Racine, C. L.; Lauderback, C. M.; Butterfield, D. A. Neurochem. Int. 2001, 39, 141. Glutathione elevation and its protective role in acrolein-induced protein damage in synaptosomal membranes: relevance to brain lipid peroxidation in neurodegenerative disease.
(31)Esterbauer, H.; Schaur, R. J.; Zollner, H. Free Radic. Biol. Med. 1991, 11, 81. CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF 4-HYDROXYNONENAL, MALONALDEHYDE AND RELATED ALDEHYDES.
(32)Furuhata, A.; Nakamura, M.; Osawa, T.; Uchida, K. J. Biol. Chem. 2002, 277, 27919. Thiolation of protein-bound carcinogenic aldehyde - An electrophilic acrolein-lysine adduct that covalently binds to thiols.
(33)Gan, J. C.; Oandasan, A.; Ansari, G. A. S. Chemosphere 1991, 23, 939. INVITRO COVALENT MODIFICATION OF SERUM-ALBUMIN BY ACROLEIN.
(34)Gan, J. C.; Ansari, G. A. S. Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology 1987, 55, 419. PLAUSIBLE MECHANISM OF INACTIVATION OF PLASMA ALPHA-1-PROTEINASE INHIBITOR BY ACROLEIN.
(35)Hsu, C. Y.; Huang, J. W.; Lin, K. J. Chem. Commun. 2011, 47, 872. High sensitivity and selectivity of human antibody attachment at the interstices between substrate-bound gold nanoparticles.
(36)http://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-336-acrolein-lys-elisa-kit.pdf
(37)Chen, H.; Shen, X. Y.; Gu, W.; Gu, R. A.; Liu, J. X.; Ren, B.; Tian, Z. Q. Spectrosc. Spectr. Anal. 2004, 24, 543. Adsorption studies of gamma-aminopropyltrimethoxysilane on iron surfaces by surface-enhanced Raman spectroscopy.
(38)Abcam. Anti-Acrolein (conjugated) antibody datasheet.