臺灣博碩士論文加值系統

半個多世紀以來，植物細胞的全能性 (totipotency) ，已陸續地從許不同物種利用組織培養的技術得以確認。近年來，隨著動物幹細胞領域研究與醫療、美容業的蓬勃發展，以及草本萃取物大量商品化的廣泛應用，吾輩也開始思考：「在植物細胞具有強大全能分化性的同時，特定物種是否也俱備了足以影響特定動物組織(或細胞)的再生能力？」所以，我們嘗試選用由多種台灣蝴蝶蘭 (Phalaenopsis spp. hybrid) 胚胎所製備之蘭胚素，進而分析其對於不同動物細胞之基本生理性質影響。
實驗初期採用成大蘭花研究中心所提供的四種蘭胚素H0、A2、H3以及H4，以DPPH檢測其抗氧化能力。由結果顯示，H0抗氧化效果最佳，後遂以肌原母細胞 (C2C12) 、 纖維母細胞 (NIH-3T3) 以及角質細胞 (XB2) 檢測MTT生物活性測試、細胞增生能力測試、細胞內毒性測試。並利用黑色素細胞 (B16-F10) 檢測蘭胚素抑制黑色素生成之能力。

Half century ago, the totipotency of the plant cells has been verified by plant tissue culture on many species one after another. In recent years, coming along with the broad application of animal stem cells on medicine, cosmetology and plant extract merchandising; we start to ponder a question, “Whether some specific plant species possess the ability to influence the regeneration of animal tissue or cells when the plant cells acquire the great totipotency.” Hence, we used orchid embryonin from various kinds of Moth Orchid (Phalaenopsis sub.) to analyze its influence on basic physical properties of different animal cells.

At first, the experiment was focused on the four kinds of orchid embryonin: H0, A2, H3 and H4 by NCKU Orchid Research Center to examine the antioxidant capacity through DPPH. This research discovered that the antioxidant effect of H0 was significant. Hence, this research examined MTT assay, proliferation assay, and cytotoxicity assay on C2C12 (myoblast), NIH-3T3 (fibroblast) and XB2 (keratinocytes) through embryonin treatment. Besides, we used B16-F10 (melanocyte) to test its ability of reducing the growth of melanin.

目錄
頁數
中文摘要---------------------------------------------------------------------- 1
英文摘要---------------------------------------------------------------------- 2
致謝---------------------------------------------------------------------------- 3
目錄---------------------------------------------------------------------------- 5
圖目錄------------------------------------------------------------------------- 8
英文縮寫對照表------------------------------------------------------------- 12

第一章：前言---------------------------------------------------------------- 13
1.1 幹細胞 (stem cell) -------------------------------------------------- 13
1.2 胚胎幹細胞 (embryonic stem cell) ------------------------------ 14
1.3 植物胚胎幹細胞 (plant embryonic stem cell) ----------------- 15
1.4 台灣蝴蝶蘭以及蘭花胚胎素 (蘭胚素) ------------------------ 16
1.5 實驗目標------------------------------------------------------------- 18

第二章：實驗材料與方法------------------------------------------------- 20
2.1 實驗細胞株----------------------------------------------------------- 20
2.2 實驗藥品-------------------------------------------------------------- 20
2.3實驗方法--------------------------------------------------------------- 22
2.3.1台灣蝴蝶蘭胚胎素製備-------------------------------------- 22
2.3.2 細胞培養------------------------------------------------------- 23
2.3.3 細胞存活實驗 (MTT assay) ------------------------------- 23
2.3.4 細胞增生檢測 (Cell Proliferation assay) ---------------- 24
2.3.5 細胞內毒性測驗 (Cytotoyxicity assay) ------------------ 25
2.3.6 西方點墨法 (Western blotting assay ) -------------------- 25
2.3.7螢光染色 (Fluorescence) ------------------------------------ 29
2.3.8 抗氧化活性試驗---------------------------------------------- 31
2.3.9 黑色素生成測定---------------------------------------------- 32

第三章：結果---------------------------------------------------------------- 33
3.1 H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素之抗氧化能力檢測-- 33
3.2 不同濃度之H0蘭胚素對C2C12肌原母細胞株活性的
影響-------------------------------------------------------------------- 33
3.3 不同濃度之H0蘭胚素對NIH-3T3纖維母細胞活性的
影響-------------------------------------------------------------------- 34
3.4 不同濃度之H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素對XB2
角質細胞活性的影響----------------------------------------------- 34
3.5 不同濃度之蘭胚素對各細胞株之細胞形態的影響---------- 35
3.6檢測適當濃度之H0蘭胚素對C2C12肌原母細胞株細胞
增生與細胞內毒性之影響----------------------------------------- 36
3.7 檢測適當濃度之H0蘭胚素對NIH-3T3纖維母細胞株細
胞增生與細胞內毒性之影響-------------------------------------- 37
3.8 檢測適當濃度之H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素對
XB2角質細胞株細胞增生與細胞內毒性之影響-------------- 37
3.9蘭胚素對C2C12肌原母細胞株、NIH-3T3纖維母細胞株
以及XB2角質細胞株之細胞增生相關路徑 (ERK pathway)
的蛋白質表現差異--------------------------------------------------- 38
3.10 不同濃度之H0蘭胚素對B16-F10黑色素細胞株活性的
影響--------------------------------------------------------------------- 39
3.11 不同濃度之H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素對
B16-F10黑色素細胞株之細胞形態的影------------------------ 39
3.12 檢測適當濃度之H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素對
B16-F10黑色素細胞株細胞內毒性之影響--------------------- 40
3.13 不同濃度之H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素對
B16-F10黑色素細胞株抑制黑色素生成之影------------------ 41

第四章：討論---------------------------------------------------------------- 42
4.1 蘭胚素成份探討----------------------------------------------------- 42
4.2 蘭胚素處理對C2C12肌原母細胞株、NIH-3T3纖維母
細胞株與XB2角質細胞株細胞增生力之分析----------------- 43
4.3蘭胚素對B16-F10黑色素細胞抑制黑色素生成之探討----- 45
4.4蘭胚素之未來應用方向--------------------------------------------- 47

第五章：參考文獻---------------------------------------------------------- 49
圖------------------------------------------------------------------------------- 52
附錄---------------------------------------------------------------------------- 96














圖目錄
頁數
圖一. DPPH檢測四種不同成分之蘭胚素的抗氧化能力----------- 52
圖二. 不同濃度H0蘭胚素處理C2C12肌原母細胞之MTT細胞
活性實驗測定------------------------------------------------------- 53
圖三. 不同濃度H0蘭胚素處理NIH-3T3纖維母細胞5 MTT細胞
活性實驗測定------------------------------------------------------- 54
圖四. 不同濃度H0蘭胚素處理XB2角質細胞之MTT細胞活性
實驗測定------------------------------------------------------------ 55
圖五. 不同濃度A2蘭胚素處理XB2角質細胞之MTT細胞活性
實驗測定------------------------------------------------------------ 56
圖六. 不同濃度H3蘭胚素處理XB2角質細胞之MTT細胞活性
實驗測定------------------------------------------------------------ 57
圖七. 不同濃度H4蘭胚素處理XB2角質細胞之MTT細胞活性
實驗測定------------------------------------------------------------ 58
圖八. 用顯微鏡觀察不同濃度H0蘭胚素處理下C2C12肌
原母細胞的影響---------------------------------------------------- 59
圖九. 用顯微鏡觀察不同濃度H0蘭胚素處理下NIH-3T3
纖維母細胞的影響-------------------------------------------------- 60
圖十. 用顯微鏡觀察不同濃度H0蘭胚素處理下XB2角質
細胞的影響---------------------------------------------------------- 61
圖十一. 用顯微鏡觀察不同濃度A2蘭胚素處理下XB2角質
細胞的影響---------------------------------------------------------- 62
圖十二. 用顯微鏡觀察不同濃度H3蘭胚素處理下XB2角質
細胞的影響---------------------------------------------------------- 63
圖十三. 用顯微鏡觀察不同濃度H4蘭胚素處理下XB2角質
細胞的影響---------------------------------------------------------- 64
圖十四. 利用螢光染色檢測不同濃度H0蘭胚素處理下
C2C12肌原母細胞的影響---------------------------------------- 65
圖十五. 利用螢光染色檢測不同濃度H0蘭胚素處理下
NIH-3T3纖維母細胞的影響------------------------------------- 66
圖十六. 利用螢光染色檢測不同濃度H0蘭胚素處理下
XB2角質細胞的影響---------------------------------------------- 67
圖十七. 利用螢光染色檢測不同濃度A2蘭胚素處理下
XB2角質細胞的影響--------------------------------------------- 68
圖十八. 利用螢光染色檢測不同濃度H3蘭胚素處理下
XB2角質細胞的影響---------------------------------------------- 69
圖十九. 利用螢光染色檢測不同濃度H4蘭胚素處理下
XB2角質細胞的影響---------------------------------------------- 70
圖二十. H0蘭胚素對C2C12肌原母細胞株細胞增生之
影響------------------------------------------------------------------- 71
圖二十一. H0蘭胚素對NIH-3T3纖維母細胞株細胞增生之
影響-------------------------------------------------------------------- 72
圖二十二. H0蘭胚素對C2C12肌原母細胞株以及NIH-3T3
纖維母細胞株細胞內毒性之影響------------------------------- 73
圖二十三. H0蘭胚素對XB2角質細胞株細胞增生之影響--------- 74
圖二十四. A2蘭胚素對XB2角質細胞株細胞增生之影響--------- 75
圖二十五. H3蘭胚素對XB2角質細胞株細胞增生之影響--------- 76
圖二十六. H4蘭胚素對XB2角質細胞株細胞增生之影響--------- 77
圖二十七. 各蘭胚素對XB2角質細胞株細胞內毒性之影響--------78
圖二十八. 適當濃度之H0蘭胚素處理C2C12肌原母細胞
對細胞增生路徑 (ERKpathway) 之蛋白表現差異---------- 79
圖二十九. 適當濃度之H0蘭胚素處理NIH-3T3纖維母細胞
對細胞增生路徑 (ERK pathway) 之蛋白表現差異---------- 80
圖三十. 各蘭胚素處理XB2角質細胞對細胞增生路徑
(ERK pathway) 之蛋白表現差異--------------------------------- 81
圖三十一. 不同濃度H0蘭胚素處理B16-F10黑色素細胞之MTT
細胞活性實驗測定------------------------------------------------- 82
圖三十二. 不同濃度A2蘭胚素處理B16-F10黑色素細胞之MTT
細胞活性實驗測定------------------------------------------------- 83
圖三十三. 不同濃度H3蘭胚素處理B16-F10黑色素細胞之MTT
細胞活性實驗測定------------------------------------------------- 84
圖三十四. 不同濃度H4蘭胚素處理B16-F10黑色素細胞之MTT
細胞活性實驗測定------------------------------------------------- 85
圖三十五. 用顯微鏡觀察不同濃度H0蘭胚素處理下F16-10
黑色素細胞瘤的影響---------------------------------------------- 86
圖三十六. 用顯微鏡觀察不同濃度A2蘭胚素處理下F16-10
黑色素細胞瘤的影響---------------------------------------------- 87
圖三十七. 用顯微鏡觀察不同濃度H3蘭胚素處理下F16-10
黑色素細胞瘤的影響-----------------------------------------------88
圖三十八. 用顯微鏡觀察不同濃度H4蘭胚素處理下F16-10
黑色素細胞瘤的影響---------------------------------------------- 89
圖三十九. 利用螢光染色檢測不同濃度H0蘭胚素處理下B16-F10黑色素細胞的影響-------------------------------------- 90
圖四十. 利用螢光染色檢測不同濃度A2蘭胚素處理下B16-F10黑色素細胞的影響------------------------------------------------- 91
圖四十一. 利用螢光染色檢測不同濃度H3蘭胚素處理下B16-F10黑色素細胞的影響-------------------------------------- 92
圖四十二. 利用螢光染色檢測不同濃度H4蘭胚素處理下B16-F10黑色素細胞的影響-------------------------------------- 93

圖四十三. 各蘭胚素對B16-F10黑色素細胞株細胞內毒性之
影響------------------------------------------------------------------- 94
圖四十四. 不同濃度之H0、A2、H3以及H4共4種蘭胚素對
B16-F10黑色素細胞抑制黑色素生成之影響---------------- 95

附錄一. 蘭花研究中心蘭胚素處理程序------------------------------- 96
附錄二. 利用蘭花寡核甘酸生物晶片檢測蘭胚基因表現--------- 97
附錄三. 比較蘭胚與蘭葉之基因表現---------------------------------- 98

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