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研究生:楊忠軒
論文名稱:多醣體受體之基因表現系統建立
指導教授:吳美莉吳美莉引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立屏東科技大學
系所名稱:食品科學系所
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:101
語文別:中文
中文關鍵詞:多醣體受體多醣體基因表現系統
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多醣體受體為辨識多醣體之特定受體,主要表現在白血球與巨噬細胞上。此多醣體受體屬於C型凝集素之一擁有胞外醣類辨識功能部位(CRD)。多醣體為存在真菌和酵母菌細胞壁結構中之化合物,參與體內病原菌之免疫辨識。且多醣體與多醣體受體的結合會誘發免疫細胞進行活化免疫系統的反應。研究中,將人類多醣體受體之cDNA進行片段編碼,利用設計之引子經聚合酶連鎖反應擴增目標基因並構築至表現載體上,透過限制酶分析和聚合酶連鎖反應證實基因構築完成,進行同源重組後,抽取質粒。將質粒轉染進入細胞中,生產重組蛋白,再感染細胞行表現蛋白。以西方墨點法分析多醣體受體之蛋白質表現分子量符合預估數值。高親和力表現之多醣體受體將應用於具生物活性之多醣體體外篩選系統。
目 錄
摘要 II
Abstract III
謝 誌 IV
目 錄 V
圖表目錄 IX
第一章 前 言 1
第二章 文獻回顧 2
2.1 先天性免疫反應 2
2.2 β-glucan特性 3
2.3 Dectin-1受體 3
2.3.1 Dectin-1受體之表現 3
2.3.2 Dectin-1受體之結構與功能特性 3
2.4 桿狀病毒表現系統 (Baculovirus expression system) 4
2.4.1 桿狀病毒之分類 5
2.4.2 桿狀病毒之結構 5
2.4.3 桿狀病毒之生活史 7
2.4.4 桿狀病毒之基因表現 8
2.4.5 桿狀病毒基因操作流程 9
第三章 材料方法 11
3.1 本實驗使用之菌株、細胞種類及材料儀器設備 11
3.1.1 菌株種類 11
3.1.2 細胞株種類 11
3.1.3 載體 11
3.1.4 儀器設備 12
3.2 基因選殖 12
3.2.1 核糖核酸濃度的定量與計算 12
3.2.2 引子 (primer)之設計 12
3.2.3 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction. PCR) 13
3.2.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳 13
3.2.5 DNA膠體純化 (Gel purification) 14
3.2.6 TA clone 接合反應 14
3.2.7 勝任細胞(Competent cell)之製備 15
3.2.8 轉型作用 (Transformation) 16
3.2.9 藍白篩選 (Blue/White screeing) 16
3.2.10 以PCR方式確定是否含有選殖基因HisDectin-1片段 17
3.2.11 yT&;A-HisDectin-1質體之萃取 17
3.2.12 以限制酵素處理帶有選殖HisDectin-1基因片段 18
3.2.13 定序 (Sequencing) 19
3.3 桿狀病毒表現系統Baculovirus expression vector system (BEVS) 19
3.3.1 pBacPAK 8、pBacPAK 8 gp及yT&;A-HisDectin-1轉型載體之構築 19
3.3.2 Bacmid質體之萃取 22
3.3.3 細胞株之培養 24
3.3.4 昆蟲細胞Sf9之轉染作用(Transfection) 26
3.3.5重組桿狀病毒 26
3.3.6測定病毒斑(Viral plaque assay) 27
3.3.7表現重組蛋白HisDectin-1和gpHisDectin-1 28
3.3.8 重組蛋白分析 32
第四章 結果與討論 33
4.1 人類Dectin-1基因之選殖 33
4.1.1 HisDectin-1載體之構築 33
4.2桿狀病毒表現系統 (Baculovirus expression system) 33
4.2.1 pBacPAK 8-HisDectin-1及pBacPAK 8-gpHisDectin-1載體之構築 33
4.2.3 增幅可表現HisDectin-1及gpHisDectin-1之重組Baculovirus 33
4.2.4以Western blot分析重組蛋白HisDectin-1和gpHisDectin-1之表現 34
第五章 結 論 55
參考文獻 56
作者簡介 60


圖目錄
附圖1、加州苜蓿尺蠖蛾核多角體之桿狀病毒外觀 6
附圖2、桿狀病毒生活史 8
附圖3、Bac-to-Bac® Baculovirus 表現系統 10
圖1、yT&;A-HisDectin-1 DNA電泳分析 37
圖2、yT&;A-HisDectin-1 DNA電泳分析 38
圖3、pBacPak8-HisDectin-1 DNA電泳分析 39
圖4、pBacPak8 gpHisDectin-1 DNA電泳分析 40
圖5、昆蟲細胞受病毒感染情形 41
圖6、HisDectin-1病毒DNA電泳分析 42
圖7、gpHisDectin-1病毒DNA電泳分析 43
圖8、SDS-PAGE與西方墨點法分析BV-HisDectin-1重組蛋白 44
圖9、SDS-PAGE與西方墨點法分析gpHisDectin-1重組蛋白 45
圖10、BV-HisDectin-1感染Hi-5細胞死亡率 46
圖11、BV-HisDectin-1感染Hi-5細胞最佳時間之蛋白質SDS-PAGE分析 47
圖12、西方墨點法分析BV-HisDectin-1感染Hi-5細胞固定時間點之蛋白質之抗原性 48
圖13、gpHisDectin-1感染Hi-5細胞死亡率 49
圖14、BV-gpHisDectin-1感染Hi-5細胞最佳時間之蛋白質SDS-PAGE分析 50
圖15、西方墨點法分析BV-gpHisDectin-1感染Hi-5細胞固定時間點之蛋白質之抗原性 51
圖16、SDSPAGE分析BV-HisDectin-1與BV-gpHisDectin-1感染Hi-5細胞織重組蛋白量 52
圖17、共軛聚焦顯微鏡觀察HisDectin-1受體於細胞膜表現情形 53
圖18、共軛聚焦顯微鏡觀察gpHisDectin-1受體於細胞膜表現情形 54


表目錄
表1、選殖hDectin-1全長cDNA之引子 36

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